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       單克隆分離技術(shù)主要包括有限稀釋法、克隆環(huán)法和顯微操作法。有限稀釋法是通過將細(xì)胞懸液連續(xù)梯度稀釋，使最終在細(xì)胞培養(yǎng)板的一個(gè)孔中僅有1個(gè)細(xì)胞，再經(jīng)過兩周左右時(shí)間增殖，形成細(xì)胞群，再經(jīng)過驗(yàn)證獲得穩(wěn)定克??；克隆環(huán)法是通過在10-15cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞接種低密度,使分散的單個(gè)細(xì)胞各自增殖成細(xì)胞群，用克隆環(huán)方式與周圍的細(xì)胞隔離開，通過胰酶消化，轉(zhuǎn)到新的孔板中繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增，并檢測驗(yàn)證而獲得穩(wěn)定克?。伙@微操作法是借助顯微鏡，在放大的視野下挑取單細(xì)胞，再轉(zhuǎn)至培養(yǎng)孔中，逐漸擴(kuò)增獲得單克隆。

　　這三種方法有各自一定的局限性：有限稀釋法對(duì)懸浮細(xì)胞較為合適，但是實(shí)際中貼壁細(xì)胞的需求占絕大多少，而且很多細(xì)胞在極低密度下生長極慢甚至不能生長，無法進(jìn)行單細(xì)胞克隆；克隆環(huán)法不僅需要購買克隆環(huán)，而且因?yàn)榧?xì)胞數(shù)量較少時(shí)肉眼難辨，必須等到細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增到幾百時(shí)才能進(jìn)行分離，因此需要等待較長時(shí)間，而且操作步驟多、難度大，實(shí)驗(yàn)人員通常需要有豐富經(jīng)驗(yàn)；顯微操作法需要借助昂貴的特殊顯微鏡或?qū)⒊Ｒ?guī)顯微鏡搬至安全柜內(nèi)使用，操作難度加大，而且易造成細(xì)胞污染而前功盡棄。

　　單克隆分離方法：

　　a、在培養(yǎng)皿中制備飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔細(xì)胞）單層。

　　b、臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養(yǎng)液混勻，配成1%瓊脂糖培養(yǎng)液，45℃水浴中溫育。

　　c、吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液3ml，室溫10分鐘。

　　d、取雜交瘤細(xì)胞懸液1ml，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻，鋪于上層。

　　e、37℃、7.5%濕潤培養(yǎng)7-14天；克隆生長至2mm時(shí)，用毛細(xì)吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板，擴(kuò)大培養(yǎng)。