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高產(chǎn)細胞株單克隆篩選時細胞的活性問題
近，單抗市場又迎來了一個關(guān)注的熱潮。實驗室的技術(shù)人員以及各大設(shè)備廠家，也都逐漸把目光和精力都投向了如何提高單抗藥物研發(fā)和生產(chǎn)的效率問題上了。在這一層面，各大單抗研發(fā)生產(chǎn)企業(yè)似乎都在進行賽跑。誰在整個流程中搶先一小步，那么極有可能在整個單抗藥物市場中贏得先機。
在這里，今天我們要討論的是關(guān)于在穩(wěn)定株篩選過程中，如何提高單克隆細胞的活性。大家都想把高產(chǎn)的細胞株順利地挑選出來，然后讓其穩(wěn)定地生長、增殖。真正做實驗的人員才會發(fā)現(xiàn)，其實這整個過程遠遠沒有流程設(shè)計時那么簡單。這里會涉及到一下幾個問題：
其一，挑選的方法。目前，實驗室里經(jīng)常用到的單克隆細胞篩選方法有有限稀釋法，半固體培養(yǎng)基挑選法（例如Clonpix），以及流式細胞術(shù)挑選法等。這其中有好多需要關(guān)注的點，例如挑選細胞的參數(shù)，挑選方法本身對細胞的損傷等。所以說，一個的篩選方法能讓工作效率提高好幾倍。
有限稀釋法是目前常用的一種常規(guī)武器，這種方法篩選細胞大的好處就是基本上不會傷害細胞。整個過程中細胞所經(jīng)歷的，也僅僅是在移液槍頭中的短暫停留，因此幾乎是零損傷。不過，這種方法的弊端也是顯而易見，就是效率問題。首先是鋪板效率，雖然不到一分鐘能將一塊96孔板鋪滿，但是一般來說96孔中有細胞的概率在2/3左右（按照細胞濃度會有所差別），其中單個細胞的概率就更小了。這些細胞要經(jīng)過一段時間的生長，抗體分泌之后，在其上清液中去檢測抗體含量。流程耗時太長，且效率低下。但是在沒有更先進的設(shè)備的時候，這還是目前穩(wěn)妥的選擇。
半固體培養(yǎng)基挑選法。在半固體的培養(yǎng)基上，以一定的密度“種上”細胞，并且讓細胞生長并分泌抗體。經(jīng)過一段時間之后，原先細胞的周圍會有抗體產(chǎn)生，然后對整個體系進行熒光抗體染色，并且通過熒光顯微設(shè)備檢測到熒光較強的“一團”，將其“挖”出。接著，經(jīng)過一些特定的處理環(huán)節(jié)，將細胞置于懸浮培養(yǎng)環(huán)境中，讓其生產(chǎn)抗體。這是前幾年較流行的挑選方法，優(yōu)勢非常明顯，能看到單克隆細胞，又能檢測生產(chǎn)的抗體產(chǎn)量。但是后來很多使用者發(fā)現(xiàn)，剛從半固體培養(yǎng)基“挖”出來的細胞，不適合直接培養(yǎng)生產(chǎn)抗體，而是需要在養(yǎng)兩周以上進行“排毒”。因為之前所用的熒光抗體，對細胞還是有一定的毒性。另外，很多用戶發(fā)現(xiàn)，由于生長環(huán)境的不同，原先在半固體培養(yǎng)基上挑選得到的高產(chǎn)細胞，在后續(xù)懸浮的培養(yǎng)環(huán)境中并不高產(chǎn)。
流式細胞術(shù)挑選法。流式細胞分選儀是挑選細胞的不二法寶，在細胞分析分選當中占有重要一席。在很多抗體研發(fā)企業(yè)中，也都有用到流式細胞儀來挑選高產(chǎn)細胞株。的確，流式細胞儀在這一應(yīng)用領(lǐng)域有其*優(yōu)勢，例如分析（挑選高產(chǎn)細胞），分選快速（每秒上萬個細胞）。不過，很多用戶發(fā)現(xiàn)雖然流式在這方面挑選效率很高，但是分下來的細胞活性卻很低。這和流式細胞術(shù)的原理有著極大地關(guān)系。流式細胞儀在分選過程中，整個內(nèi)部體系的壓力很大，一般有2~3個大氣壓強，細胞在這樣的環(huán)境中容易損傷。高頻震蕩出細小液滴的過程對細胞也是一種傷害。后是1nl左右的液滴高速打到板子中的過程，對細胞是個不小的碰撞。
其二，細胞狀態(tài)。挑選的過程對細胞會有所傷害，但是細胞本身的狀態(tài)對篩選之后的細胞生長和增殖也是至關(guān)重要。細胞在篩選前已經(jīng)處于活性較差的狀態(tài)，在分離成單細胞之后，更不能奢望它能有所改觀。另外，傳代次數(shù)越多，一般單細胞在生長的概率越小。所以，有時候我們在尋找或者比較篩選方法的時候，細胞的狀態(tài)也需要考慮進去。
其三，培養(yǎng)基的選擇。動物細胞本身都輸“群居”的，單個生長本身就有很大的難度。細胞在生長過程中會分泌很多復(fù)雜的生長因子。這些生長因子會促進細胞的生長和增殖，但是單個細胞生長時，這種促進作用幾乎沒有了。很多細胞其實在分離出來的時候，明明有著很好的活性，但是卻偏偏不增殖。這類細胞它會在體積上慢慢變大，長大到一定程度直接就“自爆”了。因此，一個好的condition media,就會成為每家培養(yǎng)單細胞的秘密武器。
Namocell致力于單細胞的分離分選。的微流體單細胞分離技術(shù)在抗體研發(fā)中有著很好的應(yīng)用。首先，Namocell單細胞分離儀的內(nèi)部壓力只有不到2 psi，整個分選過程無需高頻震蕩，保證了細胞活性；其次，用到激光激發(fā)和熒光接收的原理，能夠?qū)毎M行識別和篩選；后，不到1min即可分選一塊96孔板，分選速度快。