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使用凯氏定氮法测定蜂王浆粗蛋白
使用凯氏定氮法测定蜂王浆粗蛋白
1．原理
以浓硫酸消化分解蛋白质，其中的氮变成氨，再与硫酸化合生成硫酸铵。生成的硫酸铵与氢氧化钠反应再生成氨，用蒸馏法使氨蒸出，用标准浓度的硫酸溶液与其反应，剩余的硫酸再经氢氧化钠标准溶液滴定，从实际消耗的酸量可推算出生成的氨量。
2．仪器与试剂
(1)仪器：分析天平(0.000 lg)、50ml凯氏烧瓶、凯氏定氮半微量蒸馏装置1套、滴定装置1套。
(2)试剂： 浓硫酸（分析纯，密度1.84）。
硫酸铜与硫酸钾混合试剂：称取5水硫酸铜1g、硫酸钾10g，置于研钵中混合均匀，研细备用。
混合指示剂：量取0.1%次甲基红乙醇溶液2份和0.1%溴甲酚绿乙醇溶液3份，临用时混合。
2%硼酸溶液：称取硼酸2g，量取混合指示剂2ml、乙醇20ml，置于锥形瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至100ml，摇匀备用。
40%氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠40g，加蒸馏水溶解并稀释至100ml。
稀硫酸：量取浓硫酸5.7ml，加蒸馏水稀释至100ml。
0.01 mol/L的标准酸溶液
3．测定方法
(1)消化：准确称取蜂王浆样品约1g，放入干燥的凯氏烧瓶内，加入2g硫酸铜与硫酸钾混合试剂，再沿瓶壁缓缓加入61ml浓硫酸，在瓶口放一小漏斗，使烧瓶成45°斜放，在通风橱内置于电炉上加热消化（先小火缓缓加热，使溶液温度保持在沸点以下，等暴沸停止后，逐步加大火力）。待消化液呈清澈的亮绿色后，再继续加热30min，消化即可完毕（消化时间约为lh），冷却后备用。
(2)蒸馏：量取2%硼酸溶液10ml置于100ml的锥形瓶中，加入混合指示剂2滴和少量稀硫酸，将冷凝管顶端浸入液面下。然后，将凯氏烧瓶中的消化液经由漏斗移人蒸馏器中，用少量蒸馏水淋洗凯氏烧瓶和玻璃漏斗数次。向蒸馏器中加入40%氢氧化钠溶液约25ml之后，再加入5ml蒸馏水（一半流入蒸馏器，一半在玻璃杯中作水封）。用调温电炉加热开始蒸馏。待锥形瓶内溶液的颜色由酒红色变为蓝绿色时，继续蒸馏10min，将冷凝管顶端提出液面，使蒸汽继续冲洗1 min，用少量蒸馏水淋顶端，停止蒸馏。
(3)滴定：用0.01 mol/L的标准酸溶液滴定锥形瓶中吸收的氨量，滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫红色为终点，并作空白试验校正。
4．计算
式中：
V1——样品消耗标准酸溶液的体积，mL；
V2——空白消耗标准酸溶液的体积，mL；
N——标准酸溶液标定的当量浓度，mol/L；
0.014——1N标准酸溶液1mL相当于氮克数；
F——蛋白质系数，蛋白制品为6.25；
m——样品的质量，g；
D——样品的稀释倍数。
平行实验允许误差不超过±2%，取平均值确定结果。
鉴于手工操作比较繁琐，推荐使用北京优谱通用科技有限公司的1800系列全自动凯氏定氮仪进行测定，全自动操作，加酸，加碱、蒸馏、滴定、结果计算和打印输出全自动完成，无需人工干预！