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一、 探针标记
原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。
1. 按照1:1000-2000用无血清培养基稀释O06探针。
2. 去除细胞培养基，用PBS洗细胞一次。
3. 加入适当体积稀释好的O06探针。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的O06探针不少于1毫升。
4. 在37℃细胞培养箱内避光孵育20分钟。
5. 用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的O06探针。

收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理
1. 按照1:1000用无血清培养基稀释O06探针。
2. 离心移除培养基，用PBS洗细胞一次。
3. 细胞收集后悬浮于稀释好的O06探针中，细胞浓度为1*106-2*107/毫升，37℃细胞培养箱内避光孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。
4. 用无血清细胞培养基洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的O06探针。
5. 用无血清细胞培养基重悬细胞。

二、 检测：
对于原位标记探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
荧光强度强，活性氧强度高。
对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。

使用488 nm激发波长，525 nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。O06探针的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测。