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  PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。

1． 反应缓冲液：

一般随Taq DNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3室温），1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。

2． dNTP ：

高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。

3． Taq DNA聚合酶酶：

在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20μl或50μl），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。

4． 引物：

引物是决定 PCR 结果的关键，引物设计在 PCR 反应中极为重要。要保证 PCR

反应能准确、特异、有效地对模板 DNA 进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：

⑴ 引物的长度以 15-30bp 为宜，一般（G+C）的含量在 45-55%，Tm 值高于 55℃

［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出

是随机的。

⑵ 引物的 3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在 3’端

不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸

效率。两条引物间配对碱基数少于 5 个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不

能超过 3 个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。

⑶ 人工合成的寡聚核苷酸引物需经 PAGE 或离子交换 HPLC 进行纯化。

⑷ 引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），

二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低

浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用 0.25-0.5pM/μl 较好。

⑸ 引物一般用 TE 配制成较高浓度的母液（约 100μM），保存于-20℃。使用前取出其中

一部分用 ddH2O 配制成 10μM 或 20μM 的工作液。

5． 模板：

PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。
6． PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。