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     在操作大鼠心肌成纤维细胞永生化细胞专用培养基时，需特别注意以下关键步骤，以确保细胞培养的稳定性和实验结果的可靠性。

     首先，培养基的配制需严格遵循无菌操作规范。建议在超净工作台内进行，避免微生物污染。配制前需检查培养基成分是否完整，尤其是血清和生长因子的添加比例，需根据细胞状态和实验需求调整。若使用冻存培养基，需提前解冻并轻轻混匀，避免反复冻融导致有效成分降解。

     其次，细胞传代时需控制消化时间。通常使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，消化时间不宜过长，以免损伤细胞膜。消化完成后，需立即加入含血清的培养基终止反应，并轻柔吹打形成单细胞悬液。离心后弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，按适当密度接种于培养皿中。

    此外，培养环境的稳定性至关重要。细胞需置于37℃、5% CO?的恒温培养箱中，保持湿度以防止培养基蒸发。每日观察细胞状态，若发现异常（如颗粒增多、空泡化或贴壁不良），需及时排查原因，如培养基pH值变化、污染或血清质量问题。

     最后，废弃培养基和耗材需按生物安全规范处理，避免交叉污染。定期检测支原体污染，确保细胞系的纯净性。通过规范操作和细致观察，可显著提高永生化心肌成纤维细胞的培养成功率，为后续实验提供可靠模型。