猪圆环病毒1型和2型双重PCR检测试剂盒用途 本试剂盒采用实时荧光 PCR 方法检测猪血清和组织中的猪圆环病毒 1 型的 DNA，适用于
PCV-1 的检测、诊断和流行病学调查。
原理 利用离心柱内惰性大分子膜提取病料 DNA 作为模板，以引物为起点合成与 DNA 模板，在
热启动 Taq 酶的作用下，经高温变性、中温退火及延伸的循环，使特异 DNA 片段的拷贝数放大一倍，
经荧光素标记的探针与扩增的 DNA 杂交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性，使荧光探针的报告基
团与淬灭基团分离，发出特异性荧光信号，利用荧光 PCR 仪检测特异性荧光信号，根据样品 Ct 值
的大小及扩增曲线的形成情况判定结果。

试剂盒的组成

保存期 本产品有效期为 12 个月。
需要自备的物品
1．仪器：分析天平、水浴锅、离心机、荧光 PCR 扩增仪、组织研磨器、-20 ℃冰箱、可调移液器（2
µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：荧光 PCR 反应管、眼科剪、眼科镊、生理盐水、1.5 mL 灭菌离心管、吸头（10 µL、
200 µL、1000 µL）、灭菌双蒸水。
猪圆环病毒1型和2型双重PCR检测试剂盒注意事项
1．所有接触病料的物品均应合理处置，以免污染实验室。
2．PCR 整个试验分配液区、模板提取区、扩增区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区。严
禁器材和试剂倒流。
3．所有试剂应在规定的温度储存。-20℃保存的各试剂管使用前应*融化，8000 rpm 离心 15 s，
使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取，使用后立
即放回-20 ℃。
4．消化液低温时可能出现结晶，请于 37 ℃温育，溶解至澄清透明后使用。
5．注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。
6．严格遵守操作说明可以获得的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。
7．反应体系应在特定配液区或者超净工作台中配制，整个实验过程严格控制污染。
8．严格遵守操作说明可以获得的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。
9．反复冻融试剂将减低检测灵敏度，建议在 3 次内用完，请严格按试剂盒说明书操作。
样品制备
1 样品采集：病死或扑杀的猪，取肺、淋巴结等组织；待检活猪，用注射器取血 5 mL。2～8 ℃保存，
送实验室检测。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料。）
2 样品处理：每份样品分别处理。
2.1 组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约 1g，用手术剪剪碎混匀后取 0.05 g
于研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理盐水继续研磨，待匀浆后转至 1.5 mL 灭菌离心管中，8000 rpm
离心 2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 灭菌离心管中，再加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，
振荡混匀后，置 56 ℃水浴中消化 1 小时。
2.2 全血样品处理：待血凝后取血清 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振荡混匀后，
置 56 ℃水浴中消化 1 小时。
2.3 阳性对照处理：取阳性对照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振荡混匀后，置 56 ℃
水浴中消化 1 小时。
2.4 阴性对照处理：取阴性对照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振荡混匀后，置 56 ℃
水浴中消化 1 小时。
操作步骤
1 病毒 DNA 的提取
1.1 从水浴锅中取出样品管，降至室温后，加入 300 μL DNA 结合液，颠倒混匀，将全部液体移入吸
附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱），室温
静置 3 min，10000 rpm 离心 30 s。
1.2 弃去收集管中液体，加入 500 μL DNA 洗涤液，10000 rpm 离心 30 s。
1.3 重复步骤 1.2。
1.4 弃去收集管中液体，10000 rpm 空柱离心 1 min，以除去残留的 DNA 洗涤液。
1.5 将吸附柱放入新的 1.5 mL 离心管中，向柱中央加入 DNA 洗脱液（ 56 ℃预热）50 μL，室温
放置 2 min，10000 rpm 离心 30 s，离心管中液体即为模板 DNA。
2 实时荧光 PCR 操作
设被检样品、阴性对照和阳性对照总和为 N，则反应体系配制如下：
试剂 体系
无菌无核酸酶水 5.9×（N+1）µL
PCR 反应液 10×（N+1）µL
荧光探针 2.1×（N+1）µL
 将以上配制的反应体系充分混匀后，分装每个反应管中各 18 µL。
分别取 2 µL 模板 DNA，加入相应反应管中，混匀并作好标记。在荧光 PCR 扩增仪上进行以下反应：
95 ℃ 2 min；循环 95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共 40 次，每次循环的第二步（60 ℃ 35 s）收集荧光信号（报
告基团“HEX”，淬灭基团“None”，如果仪器没有 HEX 校正过，可暂时用 VIC 代替）。
结果判定
1 结果分析条件设定
阈值设定原则：阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音
情况进行调整。
2 结果描述及判定
 阳性对照 Ct 值≤30 并出现特定的扩增曲线，阴性对照无 Ct 值并且无特定扩增曲线，实验结果成
立；被检样品 Ct 值≤30 并出现特定的扩增曲线为 PCV-1 阳性；被检样品 30＜Ct＜37 并出现特定的
扩增曲线，需重新取样提取 DNA，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，则判定为阳性；被检样品
Ct 值≥37 时，超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性；对于某些未呈现 S 型曲线，但本底较高的
样品，应为阴性。