猪瘟病毒通用型RT-PCR检测试剂盒用途 猪瘟病毒（CSFV）通用型反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测试剂盒，用于检测疑似感染
动物的血清或组织中的 CSFV，适用于 CSFV 的检测、诊断和流行病学调查。该试剂盒不能用于区分
强弱毒。
原理 利用离心柱内硅基质膜提取 RNA，在反转录酶的作用下，以 RNA 为模板，以引物为起点合
成与 RNA 模板互补的 cDNA 链。在 TaqDNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的
循环，使特异 DNA段的拷贝数放大一倍。经过 35 次循环，最终使扩增 DNA段放大了数百万倍。
将扩增 DNA段进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到 DNA段的扩增带。

试剂盒的组成

保存期 本产品有效期为 6 个月。
需自备的物品
1．仪器：分析天平、离心机、PCR 扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、微
波炉、组织研磨器、-20 ℃冰箱、可调移液器（2 µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、20 mL 一次性注射器、生理盐水、琼脂糖、500 mL 量筒、500 mL
锥形瓶、经焦碳酸二乙酯（DEPC）水处理的灭菌 1.5mL 离心管和吸头（10 µL、200 µL、1000 µL）、
灭菌双蒸水。
猪瘟病毒通用型RT-PCR检测试剂盒注意事项
1．所有接触病料的物品均应合理处置，以免污染实验室。
2．PCR 整个试验分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增
区→电泳区。严禁器材和试剂倒流。
3．所有试剂应在规定的温度储存。-20℃保存的各试剂管使用前应*融化，8000 rpm 离心 15 s，使
液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取，使用后立即放
回-20 ℃。
4．在 RNA 提取过程中，避免 RNA 酶污染，尽量缩短操作时间。
5． 染色液低毒，操作时应戴上手套，避光保存，较长时间不使用请存放于 4℃，以免挥发变干。染色液和上样缓冲液使用前也请离心使液体沉于管底。
6．注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。
7．严格遵守操作说明可以获得的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。
8．反复冻融试剂将减低检测灵敏度，建议在 3 次内用完，请严格按试剂盒说明书操作。
样品制备
1 样品采集：病死或扑杀的猪，取扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织；待检活猪，用
注射器取血 5 mL。2～8 ℃保存，送实验室检测。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。）
2 样品处理：每份样品分别处理。
2.1 组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约 1g，用手术剪剪碎混匀后取 0.05 g 于
研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理盐水继续研磨，待匀浆后转至 1.5 mL 灭菌离心管中，8000 rpm 离心
2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 灭菌离心管中。
2.2 全血样品处理：待血凝后取血清 100 µL，置 1.5 mL 灭菌离心管中。
2.3 阳性对照处理：取阳性对照 100 µL，置 1.5 mL 灭菌离心管中。
2.4 阴性对照处理：取阴性对照 100 µL，置 1.5 mL 灭菌离心管中。
操作步骤
1 病毒 RNA 的提取
1.1 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液 600 µL，充分颠倒混匀，室温静置 3～5
min。
1.2 将液体吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵
塞吸附柱），13000 rpm 离心 30 s。
1.3 弃去收集管中液体，加入 600 µL 洗液，13000 rpm 离心 30 s。
1.4 重复步骤 1.3。
1.5 弃去收集管中液体，13000 rpm 空柱离心 2 min，以除去残留的洗涤液。
1.6 将吸附柱移入新的 1.5 mL 离心管中，向柱中央加入洗脱液 50 µL，室温静置 1 min，13000 rpm 离
心 30 s，离心管中液体即为模板 RNA。
2 RT-PCR 扩增
每份总体积 20 µL，含 16.8 µL RT-PCR 反应液（用前混匀），1.2 µL 酶混合液，2 µL 模板 RNA。
例如：n 份样品，配制 n+1 份，16.8×（n+1）RT-PCR 反应液，再加入 1.2×（n+1）酶混合液，
混匀后取 18 µL 分装成 n 份，分别加入 2 µL 模板 RNA，加入矿物油 20 µL 覆盖（有热盖的 PCR 扩增
仪不用加矿物油），作好标记。
在 PCR 扩增仪上进行以下程序：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min；循环 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 25
s，共 35 次；再 72 ℃延伸 10 min。
3 电泳
称 4 g 琼脂糖放于 500 mL 锥形瓶中，加入 50 倍稀释的 TAE 电泳缓冲液 200 mL（取 4 mL 50 倍AE 电泳缓冲液，用双蒸水稀释至 200 mL），于微波炉中熔解，再加入 10 µL 染色液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将 PCR 扩增产物 10 µL 混合 2 µL 上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中，以 110～120V 电压于 50 倍稀释的 TAE 电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。
结果判定 阳性对照出现 235 bp 扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。
被检样品出现 235 bp 扩增带为猪瘟病毒阳性，否则为阴性。