随机引物法DNA探针生物素标记试剂盒（B）是基于 Feinberg 和 Vogelstein 发明的随机引物标记法而开发出来的即用型DNA 探针标记试剂盒，标记过程由双链 DNA 热变性、随机引物与单链 DNA 结合、在Klenow DNA 聚合酶催化下，引物的延伸合成 DNA 探针并掺入标记的核苷酸三步组成

随机引物法DNA探针生物素标记试剂盒（B）是基于 Feinberg 和 Vogelstein 发明的随机引物标记法而开发出来的即用型DNA 探针标记试剂盒，标记过程由双链 DNA 热变性、随机引物与单链 DNA 结合、在Klenow DNA 聚合酶催化下，引物的延伸合成 DNA 探针并掺入标记的核苷酸三步组成，
可用下面的示意图表示：

随机引物法DNA探针生物素标记试剂盒（B）对 Feinberg 和 Vogelstein 经典方法进行了改良，具有下列特点：
1. 提供的标记反应液整合了除酶和模板外的所有成分，简化了反应加样步骤，提高了
标记反应的可重复性。
2. 使用无外切活性的 Klenow exo- DNA 聚合酶，已标记 DNA 探针不会被酶降解。
3. 快速，zui快 1 小时即可完成标记反应。
4. 得到的 DNA 探针比活性高（如果是同位素，可以达到 109cpm/ug DNA），检测灵
敏度高。
5. 所需模版 DNA 量少（只需要 10ng 以上即可），DNA 可以是各种形状（线状和环状）
的、也可以是单链或双链的，长度在 100 bp 以上均可。
6. 得到的探针长度在 200-400 nt 之间，可以用于 Southern 杂交、Northern 杂交、
原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等。
7. 提供三种标记选择，其中 90603A 可用于各种同位素标记和其他任何非同位素标记，
但需自备标记底物；90603B 和 90603C 可分别用于生物素和标记，不需自
备标记底物。
规格及成分 成 份 编 号 小塑料盒包装
2×A 型标记反应液（自备标记物型） 90603A 50 uL（仅 A 型有）
2×B 型标记反应液（生物素型） 90603B 50 uL（仅 B 型有）
2×C 型标记反应液（DIG 型） 90603C 50 uL（仅 C 型有）
dATP，2 mM 90603D 10 uL（仅 A 型有）
dTTP，2 mM 90603D 10 uL（仅 A 型有）
dGTP，2 mM 90603D 10 uL（仅 A 型有）
dCTP，2 mM 90603D 10 uL（仅 A 型有）
Klenow exo-聚合酶（2U/uL） 90603E 5 uL
超纯水 100935 1 mL
使用手册 90603sc 1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂 0.5M EDTA（pH8.0）。如果是 A 型，则需要自备标记的核苷酸。
使用方法 1. 在一干净的硅化的塑料离心管中加入下列成分：
成分 用量
模板 DNA 50-150 ng
2×标记反应液(ABC 三种之一) 10 uL
超纯水 补水到 15 uL
注意：非同位素标记物由于疏水性强，容易与常用的塑料离心管表面非特异性结合，
所以一定要使用硅化的塑料离心管。模板 DNA 并非越多越好，因为模板会在杂交反
应中跟标记的探针杂交，竞争性抑制探针跟靶分子的杂交。
2. 沸水浴 5-10 分钟，或在 PCR 仪上 100℃加热 5-10 分钟使 DNA 模版充分变性，
立即放冰上待用。注意：如果 PCR 仪器不能设置到 100℃，99℃加热 5 分钟也可。
3. 高速离心数秒使所有液体集中在管底，根据试剂盒类型加入下列成份：
试剂盒类型 成分及用量
A 型 dATP、dGTP、dCTP 各 1 uL（共 3uL，浓度均为 2mM）
自备的 2mM dTTP/标记 dUTP 混合物（见注）1uL
1 uL Klenow exo 聚合酶
B 型 1 uL Klenow exo 聚合酶
4 uL 超纯水
C 型 1 uL Klenow exo 聚合酶
4 uL 超纯水
注：上表中的 dTTP/标记 dUTP 混合物中 dTTP 和标记的 dUTP 的总浓度为 2mM
（在 20uL 体系中混合液的终浓度为 0.1mM，dTTP 与生物素或 DIG 标记的 dUTP
的比例为 65：35）。由于空间阻碍，并非标记生物素或 DIG 标记的 dUTP 越
多灵敏度越高，一般 dTTP 与标记 dUTP 的比例在 65：35 为*。但如果使用自
备 的 其 他 标 记 核 苷 酸， 如 fluorescein 、 hydroxycoumarin 、 resorufin 和
aminoallyl 标记的 dUTP，则用户需要自己摸索其与 dTTP 之间的*比例，如果
使用 32P 标记的 dUTP，则比活为 3000Ci/mmol，浓度为好为 10uCi/uL，
并且不需要加入 dTTP。
4. 轻柔吹打混匀。如有液滴沾在管壁上，高速离心数秒使所有液体集中在管底。
5. 37℃保温 1-20 小时。标记效率跟模版量和保温时间相关，具体见下表：
模版 DNA 用量
（ng）
1 小时后探针合成量
（ng）
20 小时后探针合成量
（ng）
10 80 900
30 150 1350
100 350 1650
300 750 2200
1000 1300 2600
3000 1600 2600
6. 加 1 uL 自备的 0.5M EDTA（pH 8.0）终止反应，立即放冰上待用或放-20℃保存
一年。用前需要加热 100℃ 5 分钟使 DNA 探针变性成单链，然后直接加入到杂交
反应液中即可。如果电泳检测，标记产物将是弥散状态。
注意：本方法标记核苷酸掺入率*，因此可以不经纯化直接使用。如果需要纯化，
注意不要用酚抽提法纯化非同位素（生物素、DIG 和其他等）标记的 DNA 探针，
因为这些标记分子疏水性强，能使标记的 DNA 进入疏水的有机相而丢失，但可以
用乙醇沉淀和 Sephadex G50 回收（可另购非同位素探针柱式纯化试剂盒）。对比
活高的同位素探针，由于其极其不稳定，因此应该立即使用，不要长久放置。
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