AFLP試劑盒（EcoRI-MseI）（amplified fragment length polymorphism）原理是一種結(jié)合 RFLP 和 PCR 技 術(shù)特點(diǎn)的、迄今為止Z有效分子標(biāo)記分型技術(shù)，其原理如下： 本產(chǎn)品在傳統(tǒng) AFLP-PCR 的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化而開發(fā)

AFLP試劑盒（EcoRI-MseI）的AFLP（amplified fragment length polymorphism）原理是一種結(jié)合 RFLP 和 PCR 技 術(shù)特點(diǎn)的、迄今為止zui有效分子標(biāo)記分型技術(shù)，其原理如下： 本產(chǎn)品在傳統(tǒng) AFLP-PCR 的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化而開發(fā)，
AFLP試劑盒（EcoRI-MseI）具有下列特點(diǎn)：
1. 一站式，足夠 50 次酶切-連接反應(yīng)、50 次預(yù)擴(kuò)反應(yīng)和 1600 次 AFLP PCR（PCR 按 30 uL 體系計(jì)算），但不包括 DNA 純化和帶型分析試劑（如 PAGE 電泳試劑和 銀染試劑）。
2. 本系列產(chǎn)品提供 EcoRI-MseI 組合，適用于 GC 含量在 50%以上的基因組。對(duì) GC 含量在 50%以下的基因組，需從本公司采購(gòu) AFLP（EcoRI-TaqI）組合。
3. 各種參數(shù)都經(jīng)過(guò)優(yōu)化，一次 PCR 所得 AFLP 段數(shù)一般在 10-100 之間，可重復(fù) 性好，誤差小于 0.6%。4. 本產(chǎn)品適用于基因組在 500 Mb-6000 Mb 的材料（如動(dòng)物和植物），對(duì)于基因組 在 50-500 Mb 的材料（如細(xì)菌和真菌）或 50Mb 以下的材料（如質(zhì)粒，cosmid， BAC，YAC 和 PAC 等），需要分別另購(gòu)專門的+1 型預(yù)擴(kuò)引物混合液和+3 型 EcoRI 引物（8 種）AFLP 引物對(duì)。

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存, 有效期一年。
自備試劑 Southern 級(jí) DNA 純化試劑，尿素-PAGE 電泳套裝，銀染試劑盒。
使用方法 一、 DNA 提?。ū驹噭┖胁惶峁┫嚓P(guān)試劑）
用戶需要自備 50-500ng Southern 級(jí)別的基因組 DNA，用前預(yù)實(shí)驗(yàn)以確保 DNA 能
夠被 EcoRI 和 MseI 內(nèi)切酶*切開。
二、 限制性酶切和接頭連接反應(yīng)（本試劑盒足夠 50 次本反應(yīng)）
1. 在 0.2 mL 離心管中加入設(shè)置 20 uL 的限制性內(nèi)切酶酶切體系：
成分 用量
酶切-連接 Buffer，10× 2 uL
樣品 DNA
50 ng（對(duì)小基因組材料）
500 ng（對(duì)大基因組材料）
如果用對(duì)照，則用 5uL
EcoR I-Mse I 酶混合液 2 uL
超純水 加水到 20 uL
2. 輕柔混勻并短暫離心后，37℃保溫 2 小時(shí)酶切（若 PCR 儀器不帶熱蓋，則必須加 50uL自備石蠟油，否則水分會(huì)蒸發(fā)影響反應(yīng)。下同），70℃保溫 15 分鐘滅活內(nèi)切酶。
3. 在上述酶反應(yīng)體系中加入 20 uL EcoRI-MseI 接頭混合物和 1 uL T4 DNA 連接酶，輕柔混勻并短暫離心后，20℃保溫 2 小時(shí)讓接頭跟 DNA段相連。
4. 在一個(gè)離心管中加入 10 uL 上步得到的連接反應(yīng)液和 90uL TE 緩沖液，pH8，充分混勻，得到酶切-連接反應(yīng) 10 倍稀釋液，未用完的酶切-連接反應(yīng)原液（30uL）可放-20℃保存。
三、 預(yù)擴(kuò)增（本試劑盒足夠 50 次本反應(yīng)）
5. 在 0.2 mL 離心管中設(shè)置 30 uL 的 PCR 體系：
6. 離心數(shù)秒，按下列參數(shù)進(jìn)行 PCR 預(yù)擴(kuò)增：
溫度 時(shí)間
94℃ 30S
PCR（20 次） 56℃ 60S
72℃ 60S
7. 可以取 10 uL PCR 產(chǎn)物在 1.5%瓊脂糖膠上電泳檢測(cè)，產(chǎn)物為 100-1500 bp 模糊條帶。
8. 將剩下的預(yù)擴(kuò)反應(yīng)液用 TE 稀釋 50 倍，直接用于下步反應(yīng)或放-20℃保存待用。
四、選擇性 PCR 擴(kuò)增(本試劑盒足夠至少 1600 次本反應(yīng))
9. 在 0.2 mL PCR 管中，加入下列成分（如果用戶已經(jīng)知道哪個(gè)一種或幾種引物組合適合自己的材料，則直接使用；如果不知道，則需要預(yù)先測(cè)試所有 64 種組合，設(shè)置 64 個(gè) PCR反應(yīng)），下面只是一種組合：
成分 體積
預(yù)擴(kuò)反應(yīng)液 50 倍稀釋液
10. 輕柔混勻后離心數(shù)秒，按下列參數(shù)進(jìn)行 PCR：
溫度 時(shí)間
94℃ 30 秒
PCR（13 次） 65℃ 30 秒（每次循環(huán)遞減 0.7℃）
72℃ 60 秒
94℃ 30 秒
PCR（23 次） 55℃ 30 秒
72℃ 60 秒
延伸 72℃ 5 分鐘
五、尿素-PAGE 電泳和銀染
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品