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免疫組化說明
閱讀：440 發布時間：2021-9-2一、免疫組化操作步驟
1、 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐
2、 水浴鍋
（二）、試 劑1、 PBS緩沖液（pH7.2―7.4）
2、 0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液（CB,pH6.0,1000ml）
3、 3%甲醇―H2O2溶液：用30% H2O2 和80%甲醇溶液配制
4、 風裱劑：
a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0–9.5）等量混合
b. 油和TBS（PBS）配制
5、 TBS/PBS pH9.0–9.5，適用于熒光纖維鏡標本；pH7.0-7.4適合光學纖維標本
（三）、操作流程1、 脫蠟和水化：脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘
a. 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后在浸泡10分鐘
b. 無水乙醇中浸泡五分鐘
c. 95%乙醇中浸泡五分鐘
d. 75%乙醇中浸泡五分鐘
2、 抗原修復：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片
用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片需要抗原修復。
福爾馬林固定的組織有可能破壞了原來組織的抗原結構，蛋白多肽發生交聯，導致部分抗原表位封閉，結合位點減少，所以需要抗原修復，以暴露原來的抗原表位，達到充分顯露抗原，以不出現明顯脫片現象為佳。
抗原修復的幾種常用方法（供參考）
1、 微波爐加熱：
在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5-10分鐘，反復1-2次。根據玻片情況可參考采用微波加熱“3-5-3法"3分鐘溫火沸騰后靜止5分鐘，再溫火沸騰3分鐘即可。
適用的抗原：來源于人、大鼠、小鼠的組織標本；來源于其他動物種屬的組織標本。
2、 沸熱修復：
電爐或水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。
3、 高壓熱修復：
在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）.蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。（骨及軟骨組織的標本最好選擇較溫和的微波加熱修復） 。
4、 酶消化方法：
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱37℃，消化時間約為5-30分鐘。
適用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等。
1、三步法（以SP試劑盒為例）
- 石蠟切片脫蠟至水
- 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，如果采用抗原修復，可在此步后進行
- 3% H2O2 室溫孵育5~10分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，2分鐘×3次
- 5~10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時或4℃過夜
- PBS沖洗，2分鐘×3次
- 滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘
- PBS沖洗，2分鐘×3次
- 滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘
- PBS沖洗，2分鐘×3次
- 顯色劑顯色（DAB或AEC）
- 自來水充分沖洗，復染，脫水透明、封片
- 如果必要，可選用avdin封閉內源性生物素
2.SABC法
- 脫蠟、水化
- PBS洗2次各5分鐘
- 用蒸餾水或PBS配制新鮮的3% H2O2 ，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗3次
- 抗原修復
- PBS洗5分鐘
- 滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體
- 滴加Ι抗50ul,室溫靜置1小時或4℃過夜或37℃1小時
- PBS洗3次各2分鐘
- 滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分鐘
- PBS洗3次各2分鐘
- 滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘
- PBS洗4次各5分鐘
- DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色
- 脫水、透明、封片、鏡檢
- 速凍組織
- 冰凍切片4~8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱內，或進行短暫預固定后儲存于-20℃冰箱
- 室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，也可根據需要選擇其他的固定方式
- PBS沖洗，5分鐘×3次
- 用3%過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性
- PBS沖洗，5分鐘×3次
- 下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開始）