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對(duì)于很多生物研究者來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)細(xì)胞最最重要的一點(diǎn)是，在培養(yǎng)的過(guò)程中一定要注意細(xì)胞的污染，一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞污染不可避免，但可以減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴(yán)重性，所以在培養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)程中一定要注意細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境。那造成細(xì)胞污染都存在哪些方面的因素以及應(yīng)該注意哪些操作事項(xiàng)呢？
       細(xì)胞污染根據(jù)污染源主要可以分為化學(xué)性，物理性和生物性污染。
       化學(xué)性污染
       培養(yǎng)環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細(xì)胞的污染。化學(xué)物質(zhì)并不總是抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，某些化學(xué)物質(zhì)如激素就可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。不同細(xì)胞對(duì)化學(xué)物質(zhì)污染的反應(yīng)是不一樣的。未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長(zhǎng)輔助因子及儲(chǔ)存試劑的容器都可能成為化學(xué)性污染的來(lái)源。
       細(xì)胞培養(yǎng)的必需養(yǎng)分，如氨基酸，若濃度超過(guò)了合適的范圍，也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。同樣，不同細(xì)胞系其最佳培養(yǎng)條件下對(duì)血清和緩沖液的要求是不一樣的，在培養(yǎng)中應(yīng)嚴(yán)格控制。

       玻璃制品清洗過(guò)程中殘留的變性劑或肥皂(通常殘留在瓶蓋的內(nèi)表面)是最常見(jiàn)的化學(xué)性污染。為了避免金屬離子、有機(jī)分子、細(xì)胞內(nèi)毒素等物質(zhì)對(duì)水的污染，在配制液體，清洗容器時(shí)必須使用不含雜質(zhì)的超純水。

 

 

       動(dòng)物血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基，但血清又是潛在的生物及化學(xué)污染的來(lái)源。由于血清采集于多個(gè)動(dòng)物，而且不同廠商的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量各不相同，因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對(duì)不同細(xì)胞的促生長(zhǎng)能力及毒副作用取決于這些細(xì)胞的分化功能、組織來(lái)源及培養(yǎng)基的成分等因素。在進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)時(shí)，為了保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，最好選用同一批次的血清。
       細(xì)胞培養(yǎng)使用的所有物質(zhì)都應(yīng)是高純度的，并經(jīng)過(guò)機(jī)構(gòu)的鑒定，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)對(duì)上述成分進(jìn)行純度鑒定。同時(shí)，正確配置和儲(chǔ)存培養(yǎng)液及試劑也是非常重要的，應(yīng)該采取標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟，避免液體體積計(jì)算錯(cuò)誤，混用類似化合物等錯(cuò)誤。
       物理性污染
       物理性污染常常被人們所忽視或被籠統(tǒng)地歸為化學(xué)性污染。物理性污染通過(guò)影響細(xì)胞培養(yǎng)體系中的生化成分，從而影響細(xì)胞的代謝。培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫 度、放射線、振動(dòng)、輻射(紫外線或熒光)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。
       細(xì)胞、培養(yǎng)液或其它培養(yǎng)試劑暴露于放射線、輻射或過(guò)冷過(guò)熱的溫度中，可以引起細(xì)胞代謝發(fā)生改變，如細(xì)胞同步化、細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制甚至細(xì)胞死亡。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的合理設(shè)計(jì)及建立規(guī)范的操作規(guī)程，可以減少環(huán)境中物理因素對(duì)細(xì)胞的影響。孵箱應(yīng)放在溫度較恒定的環(huán)境中，周圍不能放置能引起機(jī)械振動(dòng)的設(shè)備，如離心機(jī)。
       培養(yǎng)液及培養(yǎng)試劑應(yīng)放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中，試劑周圍不能放同位素。培養(yǎng)液從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置一段時(shí)間后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以避免過(guò)冷的溫度對(duì)細(xì)胞的影響。
       微生物污染
       由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞自身沒(méi)有抵抗污染的能力，而在培養(yǎng)基中加抗生素的抗污染能力也是有限的，因而細(xì)胞微生物污染一旦發(fā)生往往是無(wú)法挽救的。一般在細(xì)胞受到污染早期或污染較輕時(shí)，能及時(shí)處理并除去污染物，部分細(xì)胞還有可能得到挽救。

       不同的微生物污染物對(duì)細(xì)胞的影響也有差別，微生物中支原體和病毒對(duì)細(xì)胞形態(tài)和技能的影響是長(zhǎng)期的，緩慢的和潛在的。而霉菌和細(xì)菌增殖迅速，能在很短的時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺滅細(xì)胞。

 

 

       霉菌污染
       種類很多，污染的多是曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成淡黃色或是白色的漂浮物，一般肉眼可見(jiàn)，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不變混濁。
       倒置顯微鏡下可以看見(jiàn)細(xì)胞之間有縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀，樹(shù)枝狀或管狀菌絲，并漂浮在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡下可以看見(jiàn)鏈狀排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形，散在細(xì)胞上及細(xì)胞周邊生長(zhǎng)。
       處理：確認(rèn)是霉菌污染，如果細(xì)胞種類不是特別珍貴，直接放棄，并將實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)*消毒。
       細(xì)菌污染
       細(xì)菌污染較常見(jiàn)的有大腸桿菌，白色葡萄球菌，假單孢菌等。加用抗菌素的培養(yǎng)液可預(yù)防和排除個(gè)別一般少量細(xì)菌的污染。一旦發(fā)生細(xì)菌污染很容易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短時(shí)間內(nèi)變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯渾濁現(xiàn)象；有時(shí)靜置的培養(yǎng)液起初不混，但稍加震蕩，就有許多混濁物漂起。
       倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時(shí)在細(xì)胞表面及周圍有大量細(xì)菌存在，細(xì)胞停止生長(zhǎng)并有中毒表現(xiàn)。必要時(shí)可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以明確細(xì)菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而有疑似污染，亦可向肉湯培養(yǎng)基內(nèi)地入少量培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)以檢測(cè)。
       處理：一般用抗生素的常用量的5~10倍作沖擊療法，用藥24~48小時(shí)后再換常規(guī)培養(yǎng)液，有時(shí)在早期污染時(shí)此法有效。細(xì)胞培養(yǎng)中用抗生素多為預(yù)防細(xì)菌污染，一半多聯(lián)合應(yīng)用。一旦發(fā)生污染后再使用抗生素常常難以*，有的抗生素只有抑菌作用而無(wú)殺菌效應(yīng)。
       支原體污染
       支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(最小直徑0.2um)并獨(dú)立生活的微生物．約有1%可通過(guò)濾菌器。支原體無(wú)細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性．可為圓形、絲狀或梨形。
       支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存(PH7.6-8.0)，對(duì)酸耐受性差。對(duì)熱比較敏感，對(duì)一般抗生素不敏感。

       支原體污染細(xì)胞后．培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁．多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解．因此易被忽視。但個(gè)別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢．甚至從培養(yǎng)器皿脫落。

       為確定有無(wú)支原體污染可做如下檢測(cè)：

       a:相差顯微境檢測(cè)；

       b:熒光染色法；

       c:電鏡檢查；

       d:DNA分子條文檢查或支原體培養(yǎng)等方法。

       處理：市場(chǎng)上有多種支原體清除試劑盒，效果比較好。

       酵母污染

       酵母到處存在，并能在合適的環(huán)境中快速生長(zhǎng)。酵母污染很容易觀察到，培養(yǎng)物變渾濁，尤其在后期。一般PH值變化很小，嚴(yán)重時(shí)，PH值升高。顯微鏡下呈卵圓形或球形顆粒，有些會(huì)芽生較小顆粒。

 

 

       病毒污染
       組織細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，如果沒(méi)有除去潛在的病毒，就會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。
       盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。
       細(xì)胞交叉污染
       細(xì)胞污染和細(xì)菌污染不同，細(xì)胞污染是由于在培養(yǎng)過(guò)程中各種細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行，而所用器具或液體混雜使用所致。這種污染沒(méi)有微生物存在，但使培養(yǎng)細(xì)胞不同種類之間發(fā)生混亂，細(xì)胞生長(zhǎng)特性，形態(tài)發(fā)生變化。有些變化輕微，不易察覺(jué)，有些則可能由于污染的細(xì)胞具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)而最終壓過(guò)原來(lái)細(xì)胞而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，最終死亡。污染過(guò)的細(xì)胞由于種類不純，無(wú)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
       預(yù)防污染方法需要考慮的注意事項(xiàng)
       進(jìn)入培養(yǎng)間時(shí)，保持雙手潔凈。使用肥皂*清洗后，酒精干燥（不用紙巾）
       佩戴手套（保證手套可以被消毒）
       穿著帶有松緊袖口的實(shí)驗(yàn)服
       不要隨便觸碰無(wú)關(guān)物品（例如：電話、門把手、甚至說(shuō)是整理頭發(fā)等）
       避免佩戴手表、戒指和其他首飾
       脫去在其他地方接觸過(guò)動(dòng)物的衣服
       患有感冒的人員需佩戴面罩
       良好規(guī)范的操作
       為您的CO2培養(yǎng)箱建立一套日常的標(biāo)準(zhǔn)清洗程序（清潔區(qū)域需要包括培養(yǎng)箱周圍的區(qū)域，特別是培養(yǎng)箱的頂部）
       經(jīng)常檢查實(shí)驗(yàn)室的其他設(shè)備是否受到污染（例如：洗手池/離心機(jī)等）
       有計(jì)劃放置您的培養(yǎng)箱，盡量減少開(kāi)門時(shí)間和不必要的移動(dòng)
       快速開(kāi)關(guān)CO2培養(yǎng)箱
       限制使用同一培養(yǎng)箱的人數(shù)
       盡快清除溢出物，之后用酒精清潔
       舍棄水純化系統(tǒng)最初得到的水
       注重培養(yǎng)過(guò)程
       細(xì)胞培養(yǎng)需要經(jīng)常性地檢查是否被污染
       使用半個(gè)開(kāi)放培養(yǎng)皿盛放組織培養(yǎng)基。開(kāi)口放置于培養(yǎng)箱中1至4個(gè)小時(shí)。蓋上培養(yǎng)皿蓋子。37℃培養(yǎng)24-72小時(shí)。觀察現(xiàn)象。
       早期發(fā)現(xiàn)污染可以提高培養(yǎng)物存活的幾率
       不要混用、共享培養(yǎng)皿或培養(yǎng)基
       不要令盛放培養(yǎng)基的容器開(kāi)口放置過(guò)長(zhǎng)時(shí)間
       *被污染的培養(yǎng)涉及物需要用高壓滅菌消毒

       盡量使用一次性預(yù)滅菌培養(yǎng)耗材