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免疫共沉淀（Co-IP）試驗(yàn)
閱讀：653 發(fā)布時(shí)間：2020-10-12
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，用于確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用。
其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來(lái)。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。
一、免疫共沉淀的優(yōu)點(diǎn)
1. 相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)。
2. 蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響。
3. 可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。
二、免疫共沉淀的缺點(diǎn)
1. 可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；
2. 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；
3. 必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。
一、試劑準(zhǔn)備
1. 預(yù)冷PBS，RIPA Buffer，細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機(jī)。
2. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，后一次吸干PBS。
3. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1 ml/107個(gè)細(xì)胞、10 cm培養(yǎng)皿或150 cm2培養(yǎng)瓶，0.5 ml/5x106個(gè)細(xì)胞、6 cm培養(yǎng)皿、75 cm2培養(yǎng)瓶）。
4. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動(dòng)15 min（EP管插冰上，置水平搖床上）。
5. 4℃，14000 g離心15 min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中。
6. 準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。
7. 每1 ml總蛋白中加入100 ul Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10 min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景。
8. 4℃，14000 g離心1 5min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除Protein A珠子。
9． （Bradford 法）做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定蛋白濃度，測(cè)前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個(gè)月）。
10. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 ug/ul，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 ug/ul）。
11. 加入一定體積的兔抗到500 ul總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異。
12. 4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育。
13. 加入100 ul Protein A瓊脂糖珠來(lái)捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫1 h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 ul "過(guò)渡抗體"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）。
14. 14000 rpm瞬時(shí)離心5 s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，800 ul/遍，RIPA buffer有時(shí)候會(huì)破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS。
15. 用60 ul 2x上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 ul足夠上三道）。
16. 將上樣樣品煮5 min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5 min變性。