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一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理

 

（一）定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法 。

 

（二）實(shí)時(shí)原理

 

1、常規(guī)PCR技術(shù)：

 

對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測。

 

2、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：

 

利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析

 

3、如何對(duì)起始模板定量？

 

通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析.

 

4、幾個(gè)概念：

 

（1）擴(kuò)增曲線 ：

 

（2） 熒光閾值：

 

（3）Ct值：

 

CT值的重現(xiàn)性：

 

5、定量原理：

 

理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n

 

非理想的PCR反應(yīng)： X=X0 (1+Ex)n

 

n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)

 

X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

 

X0：初始模板量

 

Ex：擴(kuò)增效率

 

5、標(biāo)準(zhǔn)曲線

 

6、定量

 

1）確定未知樣品的 C(t)值

 

2）通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量（2） 熒光閾值：

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

（3）Ct值：

 

 

 

CT值的重現(xiàn)性：

 

 

 

5、定量原理：

 

理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n

 

非理想的PCR反應(yīng)： X=X0 (1+Ex)n

n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)

X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

X0：初始模板量

Ex：擴(kuò)增效率

 

5、標(biāo)準(zhǔn)曲線

 

 

 

6、定量

 

1）確定未知樣品的 C(t)值

 

2）通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量