蛋白激酶C (PKC)/钙离子(Ca2+)响应途径会导致激活T细胞激活因子的核因子（NFAT）。NFAT由Ca2+和钙离子/钙调蛋白依赖的丝A酸磷酸酶钙调磷酸酶调控。在静息细胞中，NFAT蛋白被磷酸化并位于细胞质中；受到刺激后，它们会被钙调磷酸酶去磷酸化，转移到细胞核，并诱导基因表达。

NFAT报告基因-HEK293细胞系包含一个在NFAT响应元件控制下的萤火虫荧光素酶基因，该基因被稳定整合到HEK293细胞中。这个细胞系已经验证了对佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）和伊诺莫辛的刺激反应。

作为BPS Bioscience在中国的区域总代理，艾美捷科技强烈推荐BPS Bioscience销售产品NFAT 报告基因 - HEK293 细胞系 (PKC/Ca2+ 通路)。产品仅用于科研，不可用于临床诊断。

应用

? 监测细胞内钙离子水平。

? 筛选PKC/Ca2+途径的激活剂或抑制剂。

所需但未提供的材料

? PMA（LC Laboratories, #P1680）在DMSO中制备库存溶液。

? 伊诺莫辛（Sigma, #I3909）在DMSO中制备库存溶液。

? 检测培养基：解冻培养基1（无遗传霉素）

? 生长培养基1B（BPS Cat. #79531）

? 96孔组织培养板或96孔组织培养处理的白色透明底部检测板

? RO-31-8220（EMD Millipore, #557520）或其他PKC抑制剂

? 用于测量萤火虫荧光素酶活性的ONE-Step荧光素酶检测试剂（BPS Bioscience, #60690）。

? 荧光素酶检测仪

A. NFAT报告基因-HEK293细胞对TCR交联剂的反应。

1. 在生长培养基1B中收获NFAT报告基因-HEK293细胞，并将细胞以每孔约30,000个细胞的密度播种到含有45 ?l检测培养基的白色透明底部96孔微孔板中。

2. 将板在37°C的CO2培养箱中培养过夜（约18-24小时）。

3. 将TCR交联剂（PMA与伊诺莫辛）稀释到检测培养基中，达到所需最终浓度的10倍，并每孔加入5 ?l稀释液。（我们建议从30 nM PMA和1 ?M伊诺莫辛的起始浓度开始。）最终DMSO浓度可高达0.5%。

向未刺激对照孔中加入相同浓度DMSO但不含交联剂的5 ?l检测培养基。

向无细胞对照孔中加入含DMSO的50 ?l检测培养基（用于确定背景发光）。

每个处理至少设置三次重复。

4. 将细胞在37°C的CO2培养箱中培养过夜（约18小时）。

5. 第二天，使用ONE-Step荧光素酶检测系统进行荧光素酶检测：

每孔加入50 ?l ONE-Step荧光素酶试剂，并在室温下摇动约15分钟。使用荧光素酶检测仪测量发光。

6. 数据分析：从所有孔的发光读数中减去平均背景发光（无细胞对照孔）。

NFAT荧光素酶报告基因表达的诱导倍数 = 刺激孔的背景减去发光/未刺激对照孔的平均背景减去发光。

图1. NFAT报告基因（荧光素酶）-HEK293细胞对TCR交联剂伊诺莫辛与PMA的反应。

B. NFAT报告基因-HEK293细胞对TCR交联剂抑制剂的反应。

1. 在生长培养基1B中收获NFAT报告基因-HEK293细胞，并将细胞以每孔约30,000个细胞的密度播种到含有45 ?l检测培养基的白色透明底部96孔微孔板中。

2. 将板在37°C的CO2培养箱中培养过夜（约18-24小时）。

3. 将抑制剂（RO-31-8220）稀释到检测培养基中，达到所需最终浓度的10倍，并每孔加入5 ?l稀释液。最终DMSO浓度可高达0.5%。

向未抑制对照孔中加入相同浓度DMSO但不含抑制剂的5 ?l检测培养基。

4. 将TCR交联剂（PMA与伊诺莫辛）稀释到检测培养基中，达到所需最终浓度的10倍（我们建议从30 nM PMA和1 ?M伊诺莫辛的起始浓度开始）并每孔加入5 ?l稀释液。最终DMSO浓度可高达0.5%。

向未刺激对照孔中加入相同浓度DMSO但不含交联剂的5 ?l检测培养基。

向无细胞对照孔中加入含DMSO的55 ?l检测培养基（用于确定背景发光）。

每个处理至少设置三次重复。

5. 将细胞在37°C的CO2培养箱中培养过夜（约18小时）。

第二天，使用ONE-Step荧光素酶检测系统进行荧光素酶检测：

每孔加入55 ?l One-Step荧光素酶试剂，并在室温下摇动约15分钟。使用荧光素酶检测仪测量发光。

6. 数据分析：从所有孔的发光读数中减去平均背景发光（无细胞对照孔）。

通过将每种条件除以刺激孔的背景减去发光来计算NFAT荧光素酶报告基因表达的百分比。在没有RO-31-8220的情况下，用1 ?M伊诺莫辛和30 nM PMA刺激的细胞的背景减去发光被设为100%。

图2. RO-31-8220抑制PKC在PMA和伊诺莫辛诱导的NFAT报告基因（荧光素酶）-HEK293细胞中的作用。

结果以发光百分比显示。在没有RO31-8220的情况下，用1 ?M伊诺莫辛和30 nM PMA刺激的细胞的背景减去发光被设为100%。

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NFAT报告基因-HEK293细胞系NFAT报告基因-HEK293细胞系