一、技術(shù)簡(jiǎn)介

外泌體是這幾年開(kāi)始興起的一個(gè)朝陽(yáng)領(lǐng)域，它是細(xì)胞分泌的一種直徑在30-100nm（另一種說(shuō)法是 30-150nm）的膜泡結(jié)構(gòu)，可以介導(dǎo)細(xì)胞間物質(zhì)的交換和信息通訊。有研究分為9個(gè)類(lèi)別依次為：?jiǎn)文遗?、雙囊泡、多膜泡、小雙層膜泡、橢圓膜泡、小管、大管、不完整的膜泡、不規(guī)則膜泡，其中在不同類(lèi)別的囊泡中可以發(fā)現(xiàn)三個(gè)附加特征：表面具涂層的膜泡、內(nèi)含纖維的膜泡、電子致密囊泡。

相信大家對(duì)這些早已耳熟能詳，在此不多做贅述。外泌體的分離是困擾剛剛進(jìn)入該領(lǐng)域研究者的主要問(wèn)題，從分離角度講目前大家分離外泌體主要通過(guò)一下集中手段：差速超速離心法、梯度密度離心法、沉淀試劑盒、凝膠排阻分離法、膜親和試劑盒等手段，后兩者主要用于同時(shí)分離所有的胞外囊泡組分。以上諸多分離方法中，梯度密度離心的分離方法是*可以得到高純度的分離方法，但是操作相對(duì)復(fù)雜，目前使用并不廣泛。以目前的手段來(lái)說(shuō)，我們很難拿到純的外泌體組分，而多是以外泌體為主要組分的胞外微囊泡，在這里對(duì)兩者不做過(guò)多區(qū)分。關(guān)于分離的一些經(jīng)驗(yàn)技巧，朋友們可以參考 “外泌體之家” 分離鑒定板塊的相關(guān)貼子，適時(shí)在以后的文章中會(huì)詳細(xì)展開(kāi)。

外泌體的鑒定是既分離后又一個(gè)困擾研究者的問(wèn)題，一般研究者需要通過(guò)透射電鏡觀測(cè)樣本中是否存在外泌體樣結(jié)構(gòu)（通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形），通過(guò)粒子直徑分析系統(tǒng)測(cè)算和統(tǒng)計(jì)樣品中粒子的直徑分布，通過(guò)western blot檢測(cè)樣品中是否有外泌體相關(guān)marker蛋白的富集。另外，當(dāng)電鏡圖觀測(cè)到的樣品結(jié)構(gòu)不是典型外泌體樣結(jié)構(gòu)時(shí)，還需要增加免疫膠體金電鏡進(jìn)行驗(yàn)證。本文將通過(guò)納米顆粒與外泌體電鏡圖像的對(duì)比來(lái)總結(jié)外泌體電鏡圖的鑒別方法，爭(zhēng)取讓大家明白為什么外泌體電鏡需要看到具有膜結(jié)構(gòu)的茶托樣納米粒子才能算是看到了外泌體。本司采取通過(guò)透射電鏡確定外泌體大小。

二、實(shí)驗(yàn)流程

1. 外泌體戊二醛固定。

2. 清洗：用1mL PBS清洗3次，每次靜置15min。

3. e酸固定：加入0.5 mL 2%e酸溶液 4度固定2h。

4. 清洗：用1mL PBS清洗3次，每次靜置15 min。

5. 脫水：用50%、70%、80%、90%乙醇各1mL梯度脫水分別靜置15min，再用1mL 100%乙醇脫水2次，每次20min。

6. 置換：用1mL丙酮置換2次，每次靜置15min。

7. 浸漬。

8. 包埋：將樣品放入盛有純包埋劑的包埋板中。

9. 聚合：將包埋板置于65℃條件下聚合48h。

10. 染色：醋酸雙氧鈾染色 10min后清洗；醋酸鉛染色 10min后清洗。

11. 上機(jī)檢測(cè)。

12. 提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

三、服務(wù)說(shuō)明及結(jié)果

1. 客戶(hù)提供：外泌體（30 μl）或由我司分離得到外泌體。

2. 公司提供：基本實(shí)驗(yàn)步驟、圖片、數(shù)據(jù)分析結(jié)果。

3. 實(shí)驗(yàn)周期：10個(gè)工作日。