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基本信息

主題：NMT檢測抗癌藥對活體斑馬魚泌酸及神經(jīng)丘生理功能影響評價其環(huán)境毒性

期刊：Aquatic Toxicology

影響因子：4.346

研究使用平臺：NMT斑馬魚科創(chuàng)新平臺

標(biāo)題：Vincristine exposure impairs skin keratinocytes, ionocytes, and lateral-line hair cells in developing zebrafish embryos

作者：中國臺灣師范大學(xué)林豊益、Giun-Yi Hung

檢測離子/分子指標(biāo)

Ca²⁺、H⁺（pH）

檢測樣品

H⁺（pH）：斑馬魚胚胎皮膚離子細(xì)胞

Ca²⁺：斑馬魚胚胎L1神經(jīng)丘（側(cè)線毛細(xì)胞）

離子/分子流實(shí)驗(yàn)處理

斑馬魚在0、1、10、15或25 mg/L的長春新堿（vincristine，VCR）中孵育96 h

將H⁺流速微傳感器放置在斑馬魚胚胎皮膚離子細(xì)胞表面以檢測[H⁺]梯度變化（圖1D）。測得的[H⁺]梯度變化代表胚胎皮膚分泌酸的情況。用不同濃度的VCR（0、1、10、15和25 mg/L）孵育受精后96 h（96 hfp）的斑馬魚，[H⁺]梯度在用10、15和25 mg/L VCR孵育的胚胎中逐漸降低（圖1E）。

圖1. 長春新堿對96 hfp斑馬魚胚胎酸分泌的影響

通過非損傷微測技術(shù)（NMT）檢測胚胎L1神經(jīng)丘的Ca²⁺內(nèi)流速率（圖2A）。圖2B顯示，與對照組相比，1 mg/L組的Ca²⁺內(nèi)流速率減少了>20%（P <0.05）。Ca²⁺內(nèi)流速率隨著VCR濃度的增加呈劑量依賴性遞減趨勢，10 mg/L組的Ca²⁺內(nèi)流速率減少了>60%（P<0.001），15 mg/L組的Ca²⁺內(nèi)流速率幾乎檢測不到（P<0.001）。25 mg/L組的神經(jīng)丘幾乎*消失，所以沒有對該組進(jìn)行測定。

圖2. 長春新堿對斑馬魚毛細(xì)胞Ca²⁺內(nèi)流的影響

其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果

• 在用VCR處理斑馬魚0~96 h期間的半致死濃度（LC₅₀）約為20.6 mg/L。

• 在VCR暴露96 h后，≥10 mg/L時，斑馬魚胚胎的心率（每分鐘）以濃度依賴的方式顯著降低。

• 隨著VCR濃度的升高，發(fā)現(xiàn)其有明顯的致畸作用，表現(xiàn)為進(jìn)行性生長遲緩、眼部尺寸縮小、S形脊柱彎曲、尾端扭曲、卵黃囊水腫、心包腔增大。

• 15和25 mg/L VCR孵育后斑馬魚胚胎體內(nèi)Ca²⁺和K⁺含量顯著降低；10、15、25 mg/L VCR孵育后Na⁺含量顯著降低。

• 10、15、25 mg/L VCR處理的胚胎HR（H⁺-ATPase rich）細(xì)胞數(shù)明顯減少。15和25 mg/L VCR處理的胚胎NaR（Na⁺/K⁺-ATPase-rich）細(xì)胞數(shù)量明顯減少。

• 用掃描電鏡觀察胚胎皮膚角質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。對照組角質(zhì)細(xì)胞為多角形上皮細(xì)胞，膜上有“指紋”（微嵴）結(jié)構(gòu)。10 mg/L組角質(zhì)細(xì)胞的微嵴變得不完整，在15和25 mg/L VCR處理時被嚴(yán)重破壞或已消失。

• 用掃描電鏡觀察不同濃度VCR孵育L1神經(jīng)丘毛束形態(tài)。10、15和25 mg/L VCR處理的胚胎毛束形態(tài)呈漸進(jìn)性變粗。10、15、25 mg/L組L1神經(jīng)丘頂端面積有所下降。

• 隨著VCR濃度增加L1神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)量逐漸減少至幾乎*消失。

總之，VCR表現(xiàn)出致畸性，并可以誘導(dǎo)斑馬魚胚胎皮膚離子細(xì)胞功能損傷。為了證明VCR誘導(dǎo)的急性胚胎毒性，本研究引入了一種非經(jīng)典的測量體軸畸形的方法，通過說明BL1、BL2以及BL1/BL2的比例，以更好地量化C型或S型的體軸曲率。在低至1 mg/L的VCR條件下，NMT可檢測到體內(nèi)側(cè)線毛細(xì)胞的功能性損傷。當(dāng)VCR≥10 mg/L時，對皮膚離子細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的損傷可導(dǎo)致離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)、心包水腫和胚胎發(fā)育障礙。所有這些功能和形態(tài)變化都是在LC₅₀水平以下發(fā)生的。使用掃描電鏡能夠可視化表皮VCR相關(guān)損傷的過程，并可能在皮膚損傷后重新上皮化。此外，NMT是檢測上皮細(xì)胞包括側(cè)線毛細(xì)胞和皮膚離子細(xì)胞功能改變的有力工具。這種斑馬魚動物模型可以在未來的生態(tài)毒理學(xué)研究中應(yīng)用，以早期預(yù)測神經(jīng)毒性藥物污染物對魚類的亞致死效應(yīng)。

測試液

0.5 mM NaCl, 0.2 mM CaSO₄, 0.2 mM MgSO₄, 0.16 mM KH₂PO₄, 0.16 mM K₂HPO₄, 0.1 mg/L tricaine, pH 7.0

儀器采購信息

據(jù)中關(guān)村NMT產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟了解，中國臺灣師范大學(xué)生命科學(xué)系林豊益教授于2019年采購了旭月公司的非損傷微測系統(tǒng)。