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基本信息

主題： NKCC2（離子轉(zhuǎn)運(yùn)體）參與胃酸分泌的實(shí)時(shí)生理證據(jù)

期刊：European Journal of Pharmacology

影響因子：3.17

研究使用平臺(tái)：NMT活體組織創(chuàng)新科研平臺(tái)

標(biāo)題：Na⁺-K⁺-2Cl^- cotransporter 2 located in the human and murine gastric mucosa is involved in secretagogue-induced gastric acid secretion and is downregulated in lipopolysaccharide-treated mice

作者：首都醫(yī)科大學(xué)朱進(jìn)霞、鄭麗飛

檢測(cè)離子/分子指標(biāo)

H⁺

檢測(cè)樣品

小鼠胃黏膜活體組織

中文摘要（谷歌機(jī)翻）

Na⁺-K⁺-2Cl^-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NKCC）在胃壁細(xì)胞中的表達(dá)異常高。布美他尼是一種強(qiáng)效的利尿劑，可阻斷NKCC，通常會(huì)導(dǎo)致胃酸分泌減少。內(nèi)毒素血癥在體內(nèi)引起低血脂癥，其中脂多糖（LPS）起著重要作用。這項(xiàng)研究旨在調(diào)查NKCC2對(duì)LPS治療的小鼠胃酸分泌及其改變的影響。非損傷微測(cè)技術(shù)（Non-invasive Micro-test Technology，NMT）和實(shí)時(shí)pH滴定結(jié)合RNA干擾被用來(lái)確定布美他尼對(duì)胃酸分泌的影響。進(jìn)行了免疫化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡研究以調(diào)查L(zhǎng)PS處理的小鼠中NKCC2表達(dá)的變化。NKCC1和NKCC2的免疫反應(yīng)性主要觀察到壁細(xì)胞的基底外側(cè)和頂膜附近。用布美他尼預(yù)處理可降低小鼠胃粘膜中組胺刺激的H⁺流速。布美他尼的頂端而不是基底外側(cè)的添加抑制了福司可林或組胺/3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）誘導(dǎo)的胃酸分泌。NKCC2 siRNA的體內(nèi)治療可抑制毛喉素誘導(dǎo)的酸分泌。在組胺刺激后，大部分NKCC2靶向胃粘膜和原代培養(yǎng)的壁細(xì)胞中的頂膜。LPS處理的小鼠的胃黏膜中NKCC2和囊泡相關(guān)膜蛋白2（VAMP2）的表達(dá)降低，但H⁺/K⁺-ATPase的表達(dá)沒(méi)有降低。布美他尼阻斷頂葉NKCC2而不是基底外側(cè)NKCC1可抑制促分泌素誘導(dǎo)的胃酸分泌，在此期間可能需要NKCC2的膜運(yùn)輸。NKCC2和VAMP2的下調(diào)可能與LPS誘導(dǎo)的胃酸分泌減少有關(guān)。

離子/分子流實(shí)驗(yàn)處理方法

10 μM布美他尼、100 μM組胺、300 μM西咪替丁分別處理小鼠胃黏

離子/分子流實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1B所示的折線圖是使用NMT技術(shù)監(jiān)測(cè)小鼠胃黏膜H⁺流速變化的結(jié)果。加入組胺（100 μM）引起H⁺流速增加，從0.52±0.02增加到0.74±0.03 pmol cm^-2 s^-1，這被組胺H₂受體拮抗劑西咪替?。?00 μM）抑制（圖1C）。布美他尼（10 μM）預(yù)處理可明顯抑制組胺誘導(dǎo)的H⁺流速，但對(duì)基礎(chǔ)H⁺流速無(wú)影響，表明NKCC在促酸分泌中起作用。

圖1 不同處理下小鼠胃黏膜H⁺流速的變化情況

其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果

• 雙重染色免疫熒光結(jié)果表明，NKCC1的免疫反應(yīng)性（IR）主要出現(xiàn)在表達(dá)H⁺/K⁺-ATPase的細(xì)胞的基底外側(cè)膜，NKCC2 IR在小鼠和人胃粘膜中H⁺/K⁺-ATPase陽(yáng)性細(xì)胞的頂端側(cè)突出。在培養(yǎng)的大鼠胃壁細(xì)胞中也觀察到NKCC2 IR。NKCC2信號(hào)也作為陽(yáng)性對(duì)照在小鼠和大鼠腎臟中進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在腎小管的頂端觀察到強(qiáng)烈的NKCC2 IR。

• 在靜息條件下，布美他尼在腔管或漿膜的處理均未顯著抑制胃酸分泌。這些結(jié)果表明，抑制頂端膜上高表達(dá)的NKCC2，可以顯著抑制促分泌素誘導(dǎo)的胃酸分泌。

• NKCC2基因敲除可降低forskolin刺激的胃酸分泌。

• 組胺刺激NKCC2在胃粘膜和培養(yǎng)壁細(xì)胞中的易位。

• 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理的小鼠中NKCC2和VAMP2表達(dá)降低。

結(jié)論

本研究揭示了NKCC2（布美他尼的腔管靶點(diǎn)）在維持胃酸分泌中的重要性。特別是，我們提出的證據(jù)表明NKCC2的膜轉(zhuǎn)位可能與酸分泌有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為胃酸分泌的復(fù)雜機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。NKCC2和VAMP2的下調(diào)可能與LPS誘導(dǎo)的胃酸分泌減少有關(guān)。

離子流實(shí)驗(yàn)使用的測(cè)試液

141.8 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 1.2 mM MgCl₂, 10 mM HEPES acid, 5.6 mM Tris, 2.56 mM CaCl₂,  2 g glucose, pH 7.4