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游离细胞药物摄取实验操作说明
阅读：6081 发布时间：2017-3-16| 提 供 商 | 上海谷研实业有限公司 | 资料大小 | 7.9KB |
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原理和目的
游离细胞摄取实验以大鼠游离肝细胞、人游离肝细胞应用较为广泛。肝细胞膜上转运体主要为有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptides,OATPs)、Na+-?；堑ㄋ峁沧硕嚯? Na+/taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP)、有机阴离子转运体（organicanion transporters, OATS )、有机阳离子转运体（organic cation transporters, OCTs）等，这些转运体介导药物在体内的肝脏分布及胆汁排泄过程。
应用胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞并取得有较高活性的游离肝细胞（或者人的肝细胞），考察肝细胞对药物的摄取动力学特征，求出有关动力学参数，以研究存在于肝细胞膜上转运体介导药物转运的机制。
本实验方法的优点是可以灵活地控制实验条件，但是会使游离肝细胞失去了细胞极性（即方向性，如血管侧和胆管侧）。可以通过使游离肝细胞与药物在一定条件下、一定时间接触后测定肝细胞摄取药物的经时曲线，求出肝清除率，并可定量预测药物在肝脏的分布及胆汁排泄。
材料
1．大鼠或者人肝细胞混悬液若干。
2．试剂 0.4％锥虫蓝、待测药物溶液、混合油（矿物油37.4g、硅油6.88g),Krebs-Hens-eleit 液（118mM NaCl，23.8mM NaHC03，4.8mM KCl，1.OmM KH2PO4，1.2mM MgSO4，12.5mM HEPES,5.OmM glucose，and 1.5mM CaCl2，调节pH 7.4）
3．仪器及试剂净化工作台、倒置显微镜、恒温水浴振荡培养箱、高速冷冻离心机、制冰机、液相色谱-质谱联用仪。
方法
1．用胶原酶灌流的方法分离肝细胞并取得有较高活性的游离肝细胞置于冰上，在计数后将其稀释成2x106/ml的悬浊液。
2．取其一部分放置于37℃恒温水浴振荡培养箱，温孵3分钟后，加入等体积待测药物，在37℃的恒温振荡条件下开始进行游离肝细胞对药物的摄取实验。
3．按所需时间点取出一定体积（一般为100ul）药物及肝细胞混合液，加到事先准备的细离心管中（0.45 ml)，离心管上、下层分别放入100ul混合油（矿物油、硅油）和5M醋酸铵溶液（图11-1）。
4．立即将有混合药液的细离心管离心，使肝细胞因重力作用从上层药物的混合液中落入下层的醋酸铵中，从而终止摄取反应的进行。
5．将终止反应后的细离心管放于-20℃保存，在测定前从混合油层将其切开，经沉淀蛋白等处理后用LC-MS进行定量测定。
结果与分析
1．确定药物的线性摄取时间（温孵时间）根据LC-MS定量测定结果计算各时间点细胞对药物的摄取量，作细胞对药物摄取量随时间变化曲线，从而确定线性摄取时间（图11-2）。
2．浓度依赖性摄取 根据确定的线性摄取时间，分别进行在37℃和4℃下的药物浓度依赖性摄取实验，了解药物的特异性摄?。?7℃）和非特异性摄?。?℃）摄取以及饱和浓度；作细胞对药物摄取速度随药物浓度变化曲线（图11-3)。
3．细胞摄取药物动力学参数 根据浓度依赖性摄取结果，由Eadie-Hofstee方程以特异性摄取初速度（υ）对初速度与药物浓度比值（υ/s）计算Km、Vmax,表征药物摄取的动力学特征（图11-4)。
注意事项
1．待摄取药物溶液中若含有DMSO，则其含量不能超过 0.1％～0.5%，因为DMSO可能会影响肝细胞摄取活性。
2．肝细胞活性鉴定用胶原酶灌流法获取的游离肝细胞，在药物摄取实验之前用0.4％锥虫蓝显微镜下观察其活性，活性大于85％可用于摄取实验。人冷冻肝细胞活性若不符合要求，可经离心纯化，直到符合要求后再应用。