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qPCR反應之你問我答

閱讀：1398 發(fā)布時間：2023-1-11

實時定量PCR技術(shù)（real-time PCR）也叫qPCR（Quantitave PCR），是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過特定數(shù)學原理對未知模板進行定量分析的方法。它是一項臨床上非常成熟的技術(shù)，目前在分子生物學領域，qPCR核酸定量好方法。目前仍在全球肆虐的SARS-CoV-2鑒定的“金標準"——核酸檢測就是通過qPCR原理進行的。

圖1 qPCR技術(shù)原理簡圖（圖片來自henrik's lab）

那么拿到一個樣本，需要經(jīng)過以下多項操作流程才能定量檢測到它的核酸含量。其中任何一個步驟操作失誤都會導致它的檢測結(jié)果出現(xiàn)異常，那讓小愛來帶您來看下出現(xiàn)常見問題的解答，為您解決qPCR實驗中的痛點！

圖2 qPCR實驗操作流程圖

FAQ:

1、無Ct值出現(xiàn)
a) 檢測熒光信號的步驟有誤：一般染料法采用72℃延伸時采集，探針法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。
b) 引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性。
c) 模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
d) 模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況。
e) 反應循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在35個循環(huán)以上，可根據(jù)實驗情況增加循環(huán)，但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號。

2、Ct值出現(xiàn)過晚
a) 擴增效率極低：優(yōu)化反應條件，嘗試三步法擴增程序，或者重新設計引物。
b) 模板濃度太低：減少稀釋度，重復實驗。
c) 模板降解：重新制備模板，重復實驗。
d) PCR產(chǎn)物太長：一般將PCR產(chǎn)物長度設計為100 bp-200 bp之間。
e) 反應體系中存在PCR反應抑制劑：一般為加入模板時帶入，導致模板質(zhì)量不高，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復實驗。

3、陰性對照出現(xiàn)明顯擴增
a) 反應體系組分（如水）被污染：實驗過程中，更換新的Mix或者水重復實驗。
b) 標本間的交叉污染或產(chǎn)物污染：反應體系在超凈工作臺內(nèi)配制，對實驗室進行嚴格的區(qū)分，減少氣溶膠污染；使用帶濾芯的槍頭。
c) 引物二聚體的出現(xiàn)：引物設計不夠優(yōu)化：應避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
d) 引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。在35循環(huán)后陰性對照出現(xiàn)擴增屬正常情況，可配合熔解曲線進行分析。

4、熔解曲線出現(xiàn)多峰
a) 非特異性擴增。
b) 引物設計不佳：避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
c) 引物濃度不佳：適當調(diào)整引物濃度。
d) 退火溫度低：提高退火溫度。
e) 模板中有基因組DNA的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的污染（DNaseI處理），或通過設計引物避免非特異性擴增。

5、出現(xiàn)引物二聚體
a) 優(yōu)化擴增條件，如提高退火溫度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。通常兩步循環(huán)(由95℃變性步驟直接進入60℃退火和延伸步驟)有利于強效擴增，因此引物設計時設定的成功退火溫度為60°C。
b) 引物濃度太高，適當降低引物濃度。
c) 可通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶，通常位于100 bp以下。

6、擴增效率低
a) 反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
b) 反應條件不佳：適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
c) 反應體系中有抑制物：一般為模板中引入，應先把模板適當稀釋，再加入到體系中，減少抑制物的影響。

7、實驗重復性差
a) 加樣體積失準：使用性能較好的移液槍，擴大反應體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應體系中。
b) 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致：定期校準儀器。
c) 模板濃度太低：模板濃度越稀，重復性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積。
d) qPCR mix沒有混勻，請使用前充分混勻。

除了實驗操作的解答外，愛必信擁有全套qPCR解決方案來一站式幫您解決qPCR實驗難題。

愛必信qPCR全套解決方案推薦產(chǎn)品

類別	貨號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格
樣本保存	abs9268	RNA樣品保存液	100mL
樣本保存	abs60330	RNA保護因子	50T
RNA提取純化	abs9331	Trizol(總RNA抽提試劑)	100mL
	abs60027	組織/細胞RNA快速提取試劑盒(Dnase I)	50T
	abs60030	病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒	50T
	abs60028	植物RNA快速提取試劑盒(DNase Ⅰ)	50T
	abs60029	全血RNA快速提取試劑盒(Dnase I)	50T
逆轉(zhuǎn)錄	abs60073	Reverse Transcriptase	10000U/10000U×5
	abs60076	Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)	50T/100T
	abs60246	逆轉(zhuǎn)錄一管化三代預混液	100T
qPCR	abs60309	一步法超級多重熒光定量PCR試劑盒(探針)	100T/250T
	abs60310	一步法超級熒光定量PCR試劑盒(探針)	100T/250T
	abs60093	Multiplex Probe One Step qRT-PCR Kit	100T/500T
	abs60086	SYBR High-Sensitivity qPCR SuperMix	1mL×5/1mL×25
	abs60087	SYBR qPCR SuperMix Plus(High ROX Premixed)	1 mL×5/1mL×25
	abs60088	SYBR qPCR SuperMix Plus(Low ROX Premixed)	1 mL×5/1mL×25
	abs60247	抗體染料法定量PCR預混液(通用ROX)	5×1mL
	abs60303	染料法熒光定量PCR試劑盒(化學修飾)	100T/200T/500T
	abs60304	染料法熒光定量PCR試劑盒(抗體修飾)	100T/200T/500T
	abs60305	探針法熒光定量PCR試劑盒	100T/200T/500T
	abs60306	UDG探針法熒光定量PCR試劑盒(防污染系統(tǒng))	100T/200T/500T
	abs60307	超級多重熒光定量PCR試劑盒(探針)	100T/200T/500T
	abs60308	UDG多重探針法熒光定量PCR試劑盒(防污染系統(tǒng))	100T/200T/500T

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