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CHIR99021的實驗參考方法介紹

閱讀:1422      發(fā)布時間:2022-10-27
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  CHIR99021(CHIR99021,CHIR 99021)是氨基嘧啶衍生物,是一種高效的GSK-3α(IC50:10 nm)和GSK-3β(IC50:6.7 nm)抑制劑,CHIR-99021對GSK-3的選擇性比接近的同源物CDC2、ERK2以及其他蛋白激酶高500倍以上。CHIR-99021激活Wnt/β-catenin信號通路,誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞的心肌向分化。
  CHIR99021的實驗參考方法介紹:
  一、激酶測定
  通過使用其His或Glu標(biāo)簽從SF9細(xì)胞中純化激酶。純化Glu標(biāo)記的蛋白質(zhì),純化His標(biāo)記的蛋白質(zhì)。激酶測定在96孔板中用適當(dāng)?shù)碾牡孜镌?00μL反應(yīng)緩沖液中進行(50mM Tris-HCl,pH 7.5,10mM MgCl 2,1mM EGTA,1mM二硫蘇糖醇,25mMβ-甘油磷酸鹽,1mM的變化)NaF和0.01%牛血清白蛋白)。肽的Km值為1至100μM。將CHIR 99021或CHIR GSKIA加入3.5μLMe2SO中,然后加入ATP至終濃度為1μM。溫育后,將三份100μL等分試樣轉(zhuǎn)移至含有100μL/孔50μMATP和20mM EDTA的Combiplate 8平板。1小時后,用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗孔5次,填充200μL閃爍液,密封,30分鐘后在閃爍計數(shù)器中計數(shù)。所有步驟均為室溫。抑制百分比計算為100×(抑制劑-無酶對照)/(Me2SO對照-無酶對照)。
  MCE尚未獨立確認(rèn)這些方法的準(zhǔn)確性。它們僅供參考。
  二、細(xì)胞分析
  使用MTT測定法在暴露于不同濃度的GSK3抑制劑三天后測定小鼠ES細(xì)胞的存活力。MTT活性的降低是一種可靠的基于代謝的測試,用于量化細(xì)胞活力;這種減少與細(xì)胞活力的喪失相關(guān)。將2,000個細(xì)胞在含有LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)基中的明膠包被的96孔板上接種過夜。第二天,將培養(yǎng)基更換為不含LIF且血清濃度降低的培養(yǎng)基,并補充0.1-1μMBIO,或1-10μMSB-216763,CHIR-99021或CHIR-98014。不含GSK3抑制劑或DMSO的基礎(chǔ)培養(yǎng)基用作對照。所有測試條件一式三份進行分析

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