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多重免疫組化VS免疫熒光

閱讀:2360      發(fā)布時間:2020-12-17
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免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique,IF )又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。


多重免疫組化(mIHC):主要的技術(shù)原理來自TSA技術(shù),TSA即酪酰胺信號放大(Tyramide signal amplification)是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測方法。該技術(shù)可與高性能染料Alexa Fluor®、傳統(tǒng)熒光染料和比色檢測系統(tǒng)相兼容。 TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結(jié)合位點),產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物,該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合,這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的生物素沉積,與隨后加入的Streptavidin—HRP/熒光基團結(jié)合,經(jīng)幾次這樣的循環(huán)放大,可以結(jié)合大量的酶分子or熒光基團,結(jié)果使其檢測信號得到幾何級放大。


mIHC和IP的區(qū)別:

 多重免疫組化(mIHC)免疫熒光(IP)
靶點數(shù)量可同時染色7色(含dapi)一般標(biāo)記三種(含dapi)大于三種效果差
一抗種類同一種屬的不同抗體即可滿足要求不同種屬的不同抗體
二抗 種類不同種屬的不同抗體連接熒光探針的不同種屬二抗
染色策略分步染色,多次重復(fù)進(jìn)行免疫組化操作樣本抗原的空間位置的差異,需要設(shè)計復(fù)雜的染色策略。樣本/靶點的差異導(dǎo)致染色策略的差異,染色過程復(fù)雜、多變  
染色效果高染色分辨率和染色特異性,信號強度更強,更穩(wěn)定,淬滅時間更長,無背景影響,各靶點的信噪比大大提高,尤其適合組織基于單細(xì)胞的定量分析亮度較弱,容易淬滅,各種抗體間存在互相影響,背景較高,對基于單細(xì)胞的定量分析不利。
實驗成本1同一種屬的一抗和二抗,價格相對便宜。
2簡單的染色策略和無需任何重復(fù)的預(yù)實驗,即可掌握整個染色技術(shù),大大縮小了預(yù)實驗的材料損耗。 
3一抗和二抗工作濃度更低,單次費用更低
1不同種屬的抗體價格存在差異,一般種屬稀少的價格高。 
2不同種屬的二抗,價格存在差異,一般稀少的種屬價格高。
3尋找合適的染色策略,復(fù)雜的多次重復(fù)的預(yù)實驗大大的增加了實驗成本
應(yīng)用范圍二抗具備通用性,因此實驗室中所有的研究領(lǐng)域均可使用二抗不具備通用性,實驗室中應(yīng)用領(lǐng)域受到局限
 

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