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轉(zhuǎn)化細胞經(jīng)典轉(zhuǎn)染技術(shù)

時間:2018-3-9閱讀:120
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轉(zhuǎn)化細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)的廣泛使用促進了人們對外源基因在哺乳動物細胞中的表達等方面的認識,并在方法學上促進了該領(lǐng)域及相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。從磷酸鈣到脂質(zhì)體,到多胺,可用于轉(zhuǎn)染的細胞種類已越來越多,轉(zhuǎn)染試劑也不斷更新?lián)Q代,而轉(zhuǎn)染也不再于將DNA轉(zhuǎn)入細胞中了,RNA,siRNA,蛋白質(zhì)等等生物大分子也進入了轉(zhuǎn)染的行列。
DEAE-葡聚糖(Diethylaminoethyl (DEAE)-dextran):這個早在1965年出現(xiàn)的轉(zhuǎn)染方法差不多是zui古董級的方法之一了,直到現(xiàn)在竟然還有少數(shù)人堅持采用。帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體可以結(jié)合帶負電的DNA分子,使得DNA復合物結(jié)合在帶負電的細胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克,也可能是細胞內(nèi)吞作用,使得DNA復合體進入細胞。DEAE-葡聚糖于瞬時轉(zhuǎn)染,可重復性好,轉(zhuǎn)染時要除掉血清。 
磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染:zui早是在1973年開始采用的。氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按一定的比例混合,形成的極微小的磷酸鈣-DNA復合物沉淀粘附到細胞膜表面,借助內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對于轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要,pH值,鈣離子濃度,DNA濃度,沉淀反應時間,細胞孵育時間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對結(jié)果產(chǎn)生影響,重復性不佳。現(xiàn)在還會操作這種古董級方法的人怕已經(jīng)不多啦。比起DEAE法這個更容易得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,但是轉(zhuǎn)原代細胞比較困難的。
電穿孔法:通過短暫的高場強電脈沖處理細胞,沿細胞膜的電壓差異會導致細胞膜暫時穿孔。DNA被認為是穿過孔擴散到細胞內(nèi)。電脈沖和場強的優(yōu)化對于成功的轉(zhuǎn)染非常重要,因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。理論上說轉(zhuǎn)化細胞電穿孔法可用于各種細胞,而且不需要另外采購特殊試劑。可是需要昂貴的設(shè)備——這個一次性投資可不便宜,而且每次轉(zhuǎn)染需要更多的細胞和DNA——因為細胞死亡率高。每種細胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進行多次優(yōu)化。
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轉(zhuǎn)化細胞

 

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