細(xì)胞凍存

1、取待凍存的細(xì)胞用胰酶消化，用培養(yǎng)基將細(xì)胞沖洗下來。800r/min離心5min，棄上清收集細(xì)胞。如果是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，可直接離心收集細(xì)胞。

2、加入適量凍存液(10%甘油+90%培養(yǎng)基，或是10%DMSO+90%培養(yǎng)基)制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞濃度宜大，3*106個(gè)/ml左右，并可適量增加小牛血清濃度至20%。

3、細(xì)胞懸液裝入凍存管中。用膠布封裹，做好標(biāo)記(注明細(xì)胞種類、時(shí)間、條件等)。

4、凍存管在4℃下存放30min，轉(zhuǎn)放-20℃1.5h~2h，再轉(zhuǎn)入-70℃4~12h后即可轉(zhuǎn)入液氮內(nèi)(-196℃)，注意進(jìn)行登記。

細(xì)胞復(fù)蘇

1、取一搪瓷杯盛上適量自來水加熱至40℃左右。

2、從液氮中取出凍存管立即投入40℃水中迅速解凍。

3、取出凍存管，用75%酒精清潔管口，打開。

4、離心去上清收集細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基洗1次，加入3ml新鮮培養(yǎng)基，于小培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

5、每日觀察細(xì)胞生長情況，如果死細(xì)胞較多，復(fù)蘇次日應(yīng)換液。待細(xì)胞長滿后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)

1、在使用含有DMSO的凍存液時(shí)，因?yàn)镈MSO在室溫狀態(tài)易損傷細(xì)胞，所以在細(xì)胞加入凍存液后應(yīng)盡快放入4℃環(huán)境中。

2、準(zhǔn)確記錄細(xì)胞的種類、凍存時(shí)間、凍存液的品種和凍存者信息。