單向瓊脂擴散試驗(Single immunodiffusion test)—人血清中IgG、IgA、IgM的測定。
單向瓊脂擴散試驗是一種定量試驗，將抗體混合于瓊脂內(nèi)，傾注于玻片或平皿上，凝固后在瓊脂上打孔，再將抗原標(biāo)本加入孔內(nèi)，經(jīng)過一定的時間，在孔的周圍出現(xiàn)抗原抗體復(fù)合物形成的沉淀環(huán)，環(huán)的大小與抗原含量和擴散時間相關(guān)。用不同濃度的抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，則未知標(biāo)本中的抗原含量即可從準(zhǔn)標(biāo)曲線中求出。本試驗主要用于檢查血清中各種免疫球蛋白和補體成份的含量。
材料
IgG、IgA、IgM免疫板、參考血清、待檢血清、微量加樣器(10微升)、量尺、紗布、生理鹽水、帶蓋方盤。
方法
1、免疫瓊脂板制備：將1.5%瓊脂(用PH8.2、0.05M的巴比妥緩沖液配成)，加熱溶化，待瓊脂冷至56℃加入適量抗血清(抗血清zui終稀釋度取決于抗血清所標(biāo)化的稀釋度)，混勻，制成厚1.5mm的瓊脂板，待瓊脂凝固后打孔，孔徑為3mm，孔距1～1.2cm。
2、稀釋參考血清及待檢血清：參考血清用0.5ml蒸餾水溶解后使用，參考血清、待檢血清稀釋按要求進行。
3、加樣：將上述稀釋參考血清分別滴入相應(yīng)的抗體免疫板的一排孔內(nèi)，其余孔滴加待檢的稀釋血清，每個檢樣加兩個孔，每孔滴加10微升。
4、擴散：將免疫板置水平濕盤內(nèi)，放進37℃溫箱，IgG免疫板擴散24小時，IgA、IgM板48小時后取出置黑色背景前觀察結(jié)果，(如果沉淀環(huán)不清晰，也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小時后觀察)，必要時可以染色后觀察。
5、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及血清標(biāo)本中IgG、IgA、IgM定量測定：測量沉淀環(huán)直徑。沉淀環(huán)直徑的大小除與抗原量相關(guān)，還與分子量和擴散時間有關(guān)。這種沉淀環(huán)直徑與抗原含量的關(guān)系不是直線相關(guān)，而是對數(shù)關(guān)系，這種關(guān)系有兩種計算方法：
(1)Mancini曲線-適用于大分子抗原和長時間擴散(>48小時)的結(jié)果處理。使用方格計算紙劃線，沉淀環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關(guān)系。公式表示：C/d2 =K(C=抗原濃度，d=沉淀環(huán)直徑，K=常數(shù))。
(2)Fehey曲線-適用于小分子抗原和較短時間(24小時)擴散的結(jié)果處理。使用半對數(shù)紙劃線，濃度的對數(shù)與沉淀環(huán)之間呈線性關(guān)系。公式表示：logC/d=K(C=抗原濃度，d=沉淀環(huán)直徑，K=常數(shù))。
結(jié)果：免疫球蛋白的含量用mg/ml表示，不同批號的參考血清其免疫球蛋白含量不一。