1、原理：

(1)計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。

(2)血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細胞數(shù)目。

(3)存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。計算細胞活率：活細胞數(shù)/(活細胞數(shù)+死細胞數(shù))×100%。計數(shù)應在臺盼蘭染色后數(shù)分鐘內完成，隨時間延長，部分活細胞也開始攝取染料;因為臺盼蘭對蛋白質有很強的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計數(shù)更為準確。

2、材料：

0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip);計數(shù)器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白細胞稀釋液(4%乙酸溶液)。

3、步驟：

(1)取50μl細胞懸浮液與50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。

(2)取少許混合液(約15μl)自血球計數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色(或紅色-Erythrosin bluish)。

(3)計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，zui后乘以104，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數(shù)。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。

注：4大格細胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4=細胞數(shù)/ml;每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml

計數(shù)板計數(shù)時，zui適濃度為5～10×105細胞/ml，此范圍外計數(shù)誤差偏大。高濃度細胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計數(shù)。

4、范例：

T75 monolayer culture制成10ml細胞懸浮液，取0.1ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數(shù)盤，計數(shù)四大方格內之細胞數(shù)目。

活細胞數(shù)/方格：55，62，49，59;死細胞數(shù)/方格：5，3，4，6;細胞總數(shù)=243

平均細胞數(shù)/方格=60.75;稀釋倍數(shù)=2;

細胞數(shù)/ml：60.75×104×2(稀釋倍數(shù))=1.22×106;

細胞數(shù)/flask(10ml)：1.22×106×10ml=12.2×106

其實理論上講處于細胞增殖期之前的細胞都可用于凍存，不過如果想要更好的效果，是取對數(shù)生長期的細胞，并注意做好凍存前的換液工作。溫馨提示，從凍存管將細胞放入或取出時，都好做好保護工作，以免受凍。