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二手測序儀技術(shù)使用指導工作
閱讀：513 發(fā)布時間：2017-9-20
二手測序儀分手工測序和自動測序，手工測序包括sanger雙脫氧鏈終止法和maxam-gilbert化學降解法。自動化測序?qū)嶋H上已成為當今 dna序列分析的主流。
二手測序儀注意事項
1．a(chǎn)bi prism 310基因分析儀是精密儀器，需專人操作、管理和維護。
2．本實驗測序pcr反應的總體積是5μl，而且未加礦物油覆蓋，所以pcr管蓋的密封性很重要，除加完試劑后蓋緊pcr管蓋外，選用pe公司的pcr管。如pcr結(jié)束后pcr液小于4～4.5μl，則此pcr反應可能失敗，不必進行純化和上樣。
3．作為測序用戶來說，只需提供純化好的dna樣品和引物，一個測序pcr反應使用的模板不同，需要的dna量也就不同，pcr測序所需模板的量較少，一般pcr產(chǎn)物需30～90ng，單鏈dna需50～100ng，雙鏈dna需200～500ng，dna的純度一般是a260nm/a280nm為 1.6～2.0，用去離子水或三蒸水溶解dna，不用te緩沖液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl較好。
4．本實驗使用的測序試劑盒是bigdye熒光標記終止底物循環(huán)測序試劑盒，一般可測dna長度為650bp左右。本儀器dna測序度為 (98.5±0.5) %，儀器不能辨讀的堿基n<2%，所需測定的長度超過了650bp，則需設計另外的引物。二手測序儀為保證測序更為準確，可設計反向引物對同一模板進行測序，相互印證。對于n堿基可進行人工核對，有時可以辨讀出來。為提高測序的度，根據(jù)星號提示位置，可人工分析該處彩色圖譜，對該處堿基作進一步核對。