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上海嘉鵬
主營(yíng)產(chǎn)品： 超微量分光光度計(jì),核酸蛋白檢測(cè)儀,超微量紫外分光光度計(jì),nano光度計(jì),超微量核酸蛋白檢測(cè)儀 |
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2021-8-26 閱讀(4862)
那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳注意事項(xiàng)及操作流程：
1、 DNA的分子大小及構(gòu)型:
不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗矁r(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線DNA>開(kāi)環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí)，環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進(jìn)入膠中，相對(duì)遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長(zhǎng)軸方向前進(jìn)（Rm>0），由此可見(jiàn)，這三種構(gòu)型的相對(duì)遷移率主要取決于凝膠濃度。
2、 瓊脂糖濃度：
一個(gè)給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA段所需膠濃度是 1.2-1.5%，分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%，DNA段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
3、 DNA分子的構(gòu)象 ：
當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開(kāi)環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的，超螺旋DNA移動(dòng)*快，而線狀雙鏈DNA移動(dòng)*慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因 為含有其他DNA引起時(shí)，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收，用同一種限制性?xún)?nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜，則為同一種 DNA。
4、 電源電壓 ：
瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實(shí)驗(yàn)條件的研究結(jié)果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場(chǎng)強(qiáng)度增加時(shí)，不同分子量的DNA段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)，片段越大，因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA段的分辨率達(dá)到*大電場(chǎng)強(qiáng)度不宜高于5V/cm。
5、 嵌入染料的存在 ：
熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng)，還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15％。
6、 離子強(qiáng)度影響 ：
電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒(méi)有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率*小，幾乎不移動(dòng)，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。 對(duì)于天然的雙鏈DNA，常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸]，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA)，一般配制成濃縮母液，儲(chǔ)于室溫。
以上就是上海嘉鵬科技有限公司為大家整理總結(jié)關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳注意事項(xiàng)及操作流程。
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