青海發(fā)光桿菌目的基因的敲除采用同源重組的方法。本實(shí)驗(yàn)首先利用谷氨酰胺合成酶基因glnA上下游引物glnA-FW和glnA-RV擴(kuò)增出glnA基因序列，大小為1335 bp。然后將其連接到pMD19-T質(zhì)粒上，構(gòu)建質(zhì)粒pMD19T-glnA。同樣的，利用引物NEO-FW和NEO-RV擴(kuò)增出新霉素抗性基因Neo，并將其連接到pMD19-T載體上，構(gòu)建質(zhì)粒pMD19T-Neo。將質(zhì)粒pMD19T-glnA和pMD19T-Neo均用NcoⅠ和PstⅠ酶進(jìn)行雙酶切，酶切后的新霉素片段連接到經(jīng)同樣酶切的pMD19T-glnA質(zhì)粒上，構(gòu)建敲除質(zhì)粒pMD19T-ΔglnA∷Neo。zui后將敲除質(zhì)粒pMD19T-ΔglnA∷Neo轉(zhuǎn)化進(jìn)入枯草芽孢桿菌WB600中進(jìn)行同源重組，在新霉素平板上篩選正確的轉(zhuǎn)化子。
青海發(fā)光桿菌將重組菌接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min過夜活化。按照初始OD600 0.1的添加量轉(zhuǎn)接于30 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)36 h，期間每隔2 h取樣1次測定菌體濃度，zui后一次取樣間隔為4 h。菌體濃度的測定以分光光度計(jì)600 nm波長下的吸光值OD600表示。OD600根據(jù)下列公式轉(zhuǎn)化為細(xì)胞干重：1 OD =0.35 g/L DCW。
Palmitic acid 20mg/支 1957/10/3 棕櫚酸
Phellodendrine chloride 10mg/支 104112-82-5 鹽酸黃柏堿
Magnoflorine iodide 10mg/支 2141/9/5 碘化木蘭花堿
(-)-Syringaresnol-4-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside 10mg/支 136997-64-3 (-)-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷
含量測定 20mg 110703-200726 人參皂苷Rgl
含量測定 1ml 110707-201011 水楊酸甲酯
含量測定 0.5ml 110710-201016 桂皮醛
含量測定 20mg 110712-201010 鹽酸水蘇堿
含量測定 20mg 110717-200204 靛玉紅
含量測定 20mg 110718-200507 酯蟾毒配基
含量測定 100mg 110728-200506 薄荷腦
青海發(fā)光桿菌
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