熒光定量PCR儀是一種用于分子生物學檢測的高靈敏度、高特異性的分析儀器。通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR（聚合酶鏈式反應）產(chǎn)物進行標記和跟蹤，實時監(jiān)測反應過程中的熒光信號變化。在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程。隨著反應循環(huán)數(shù)的增加，目標DNA的擴增會導致熒光信號的增強。通過檢測熒光信號的變化，可以繪制出熒光強度相對于循環(huán)數(shù)的擴增曲線，從而實現(xiàn)對靶DNA的定量分析。
熒光定量PCR儀的前期準備工作：
1、樣品準備
核酸提?。簭臉颖荆ㄈ缃M織、細胞、血液等）中提取DNA或RNA。提取過程中要嚴格按照相應的核酸提取試劑盒說明書操作，以確保核酸的純度和完整性。例如，使用柱式提取法時，要注意細胞裂解的充分性、結合條件的控制以及洗脫液的用量和溫度等因素。
樣品鑒定與定量：對提取的核酸進行質(zhì)量和濃度檢測?？梢允褂梅止夤舛扔嫓y定核酸的濃度，通過A260/A280比值來判斷核酸的純度（純DNA或RNA的A260/A280比值一般在1.8-2.0之間）。同時，利用瓊脂糖凝膠電泳等方法來鑒定核酸的完整性，確保沒有明顯的降解。
稀釋樣品：根據(jù)熒光定量PCR的檢測范圍和樣品中目標核酸的濃度，將樣品稀釋到合適的濃度。如果樣品濃度過高，可能會導致PCR反應過早進入平臺期，影響定量結果的準確性；如果樣品濃度過低，則可能無法檢測到足夠的信號。
2、引物和探針設計
引物設計：根據(jù)目標基因的序列信息，設計特異性的引物。引物的長度一般在18-25個堿基對之間，GC含量在40%-60%之間。引物的3'端應避免連續(xù)的G或C，且不能有互補序列，以防止引物二聚體的形成?？梢允褂脤I(yè)的引物設計軟件（如Primer3、OligoPerfect等）來進行設計，并通過BLAST等工具驗證引物的特異性。
探針設計（對于使用探針法的情況）：熒光探針的設計要考慮其與目標序列的特異性結合和熒光標記的穩(wěn)定性。探針的長度通常在15-30個堿基之間，熒光基團和淬滅基團的選擇要根據(jù)儀器的檢測通道來確定。例如，常見的熒光基團有FAM（用于檢測綠色熒光）、VIC（用于檢測黃色熒光）等，淬滅基團有TAMRA、BHQ等。
3、試劑準備
PCR反應混合液：按照試劑盒說明書配制PCR反應混合液。一般包括緩沖液、dNTPs（三磷酸脫氧核苷）、引物、探針（如果使用）、Taq DNA聚合酶（或其他合適的DNA聚合酶）等。在配制過程中，要注意各種試劑的比例和添加順序，確?；旌暇鶆?。
模板添加：將稀釋后的樣品（DNA或RNA）加入到PCR反應混合液中。加入的體積要根據(jù)PCR反應體系的總體積和樣品濃度來確定，通常每管反應體系中加入1-5μL的樣品。
11
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務