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非洲猪瘟快速检测设备价格PCR仪厂家
非洲猪瘟快速检测实验室方案
用于非洲猪瘟病毒检测的实验室，推荐配置以下设备：II级生物安全柜、高速离心机、低温冰箱、高压蒸汽灭菌器、恒温水浴锅、组织匀浆仪、移液器、PCR仪、迷你型离心机。同时，建议实验室配备合适的个人防护用品，如防护服、手套、口罩等。
非洲猪瘟快速检测实验步骤：
1.样品处理
血液样品直接用；
淋巴结、脾脏、扁桃体样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0 g于研钵中充分研磨，再加10.0 mL PBS（pH 7.2，含1万单位青霉素和1万单位链霉素）混匀（样品不足2.0 g按1:5比例加PBS），对处理的待检样品置70℃，30 min灭活后，3 000 r/min，4 ℃离心5 min，取上清液，编号备用；血球粉处理同上，只不过省掉研磨步骤。
2.猪瘟检测样品存放
采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，须放置-80 ℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。
3.非洲猪瘟快速检测操作步骤
3.1 病毒DNA的提?。ㄊ褂肁盒）
（1）待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌的1.5 mL离心管，逐管编号。
（2）每管加入Buffer A 500 L。
（3）每管分别加入已处理的待检样品、阳性对照、阴性对照各200 L，充分混匀，室温放置10分钟。
（4）取与上述离心管等量的DNase-Free吸附柱和收集管，编号。将离心管中的溶液转移至DNase-Free吸附柱，（为避免堵塞吸附柱，尽量不要吸悬浮杂质）。
（5）13000 r/min室温离心30 sec。
（6）弃去收集管液体，将吸附柱放回收集管中。
（7）吸附柱内加入600 μL Buffer B，13000 r/min离心30 sec。
（8）弃去收集管液体，将吸附柱放回收集管中。
（9）重复步骤（7），（8）。
（10）13000 r/min空柱离心2 min，去除残留液。
（11）将每个吸附柱分别移入新的1.5mL离心管中，向柱*加入50 μL Buffer C，室温静置1 min，13000 r/min离心30 sec，离心管中液体即为模板DNA。获得的DNA溶液，冰上保存备用（注意提取的DNA须在2 h内进行PCR 扩增，若需长期保存须放置-80 ℃冰箱，但应避免反复冻融）。
3.2 非洲猪瘟快速检测用荧光PCR扩增（使用B盒）
（1）从试剂盒中取出荧光PCR反应液、Taq酶，室温融化后，2 000 r/min离心5 sec。设所需PCR管数为n（n = 样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系需要20 μL 荧光PCR反应液和0.5 μL Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积小管中，充分混合均匀后，向每个PCR管中各分装20 μL。
（2）分别向上述PCR管中加入1.3.1（11）中制备的DNA溶液各5μL，盖紧管盖，500 r/min 离心30 sec。
（3）将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，作好标记。反应参数设置：
*阶段，预变性95℃/3 min；第二阶段，95℃/15 sec，52℃/10 sec，60℃/35 sec共45个循环。荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行。
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