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激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用以及操作步驟介紹
閱讀：4998 發(fā)布時(shí)間：2021-12-28
激光掃描共聚焦顯微鏡是采用激光作為光源，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用共軛聚焦原理和裝置，并利用計(jì)算機(jī)對(duì)所觀察的對(duì)象進(jìn)行數(shù)字圖象處理的一套觀察、分析和輸出系統(tǒng)。主要包括激光光源、自動(dòng)顯微鏡、掃描模塊（包括共聚焦光路通道和針孔、掃描鏡、檢測(cè)器）、數(shù)字信號(hào)處理器、計(jì)算機(jī)以及圖象輸出設(shè)備等。
主要用于組織切片、活細(xì)胞的熒光標(biāo)記、三維圖像重建分析研究；細(xì)胞生物物質(zhì)、離子的定性、定量、定時(shí)和定位分布檢測(cè)等；多重?zé)晒庥^察；長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞觀察；對(duì)材料進(jìn)行反射光直接觀察和共聚焦成像掃描，可對(duì)顯微圖像進(jìn)行普通熒光和DIC成像記錄和分析。
激光共聚焦顯微鏡操作步驟：
1.根據(jù)熒光探針的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)選擇合適的激光，激光功率，光譜濾光片和發(fā)射濾光片。
2.確定掃描方法：點(diǎn)，線，面，3D掃描。
3.確定掃描密度（分辨率）：256×256,512×512,1024×1024,2048×2048，分辨率越高，掃描速度越慢，圖像信噪比越好，但越多可能會(huì)發(fā)生光漂白。
4.選擇共焦顯微鏡物鏡的倍數(shù)和電子放大倍率：確定此條件后，確定掃描范圍，物鏡的透光率與數(shù)值孔徑（NA）的四次方成正比，并且物鏡放大倍數(shù)的平方。因此，反比例，應(yīng)盡可能選擇具有高數(shù)值孔徑的物鏡。
5.根據(jù)樣品的制備質(zhì)量，選擇合適的針孔尺寸，調(diào)節(jié)激光管電壓，光電倍增管功率，降噪等，達(dá)到最佳狀態(tài)。這些參數(shù)的選擇或設(shè)置非常緊密，應(yīng)該全面考慮。
6.確定光線切割范圍，即掃描樣品的厚度，起始位置和結(jié)束位置。
7.給出了由光切割的層數(shù)和拍攝時(shí)的累積平均次數(shù)。
8.獲取圖像并保存。