硫球球殼蝸牛探針法qPCR試劑盒（不含內(nèi)參）

Acusta despecta Gray Probe Realtime PCR Kit (without internal control)

硫球球殼蝸牛探針法qPCR試劑盒（不含內(nèi)參）產(chǎn)品及特點(diǎn)：
硫球球殼蝸牛探針法 qPCR 試劑盒是一種利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)，基于 TaqMan 探針法來特異性檢測硫球球殼蝸牛的工具。主要用于科研機(jī)構(gòu)、生態(tài)保護(hù)部門等對(duì)硫球球殼蝸牛的檢測與研究，對(duì)可能含有該蝸牛的環(huán)境樣本、生物樣本等進(jìn)行定性或定量分析，為硫球球殼蝸牛的生態(tài)研究、物種監(jiān)測等提供技術(shù)支持。它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng)。

3. 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)硫球球殼蝸牛DNA 高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量時(shí)其線性范圍不少于 5 個(gè)數(shù)量級(jí)。

6. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

7. 本產(chǎn)品只能用于科研。

規(guī)格及成分：

運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。
自備試劑 樣品 DNA。

硫球球殼蝸牛探針法qPCR試劑盒（不含內(nèi)參）使用方法：
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 6 號(hào)管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10μL 上步所得 4 號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的起始體積一樣，以此作為

PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)樣品 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)

用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（直接用第 6 步第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：

四、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須沒有數(shù)值，或者 Ct 值等于或者大于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于 40。對(duì)待測樣品，如果其 Ct 小于 40 則為陽性。如果沒有 Ct 值，或大于或等于 40 則為陰性。
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