拟南芥转基因植株的鉴定

实验试剂

0.2%的Triton X-100，10%的次氯酸钠，含20 mg/L Hygromycin的MS培养基，X-Gluc，75%乙醇，0.25 N NaOH，0.25 N HCl，Buffer ( 0.5 M Tris-HCl，pH 8.0，0.25%NP40)，RNase freeDNase (Promega)

实验设备

抽真空泵，培养箱，PCR仪，电泳装置，水浴锅

实验材料

转基因拟南芥种子

实验步骤

1. 拟南芥阳性苗的筛选

   1) 将收获的转基因种子用0.2%的Triton X-100浸泡10 min;

   2) 用10%的次氯酸钠表而消毒12 min;

   3) 灭菌水洗涤3次，每2 min一次;

   4) 用水将种子铺在含20 mg/L Hygromycin的MS培养基上，4℃黑暗培养2天;

   5) 22℃，16 hr光照培养。经Hygromycin筛选后仍然长势良好，株高高者可初步确定为阳性苗。

2. GUS基因表达分析

将转基因拟南芥植株叶片取样后，加入含有缓冲液和底物(X-Gluc终浓度为0.5 mg/ml)的离心管中，真空抽气使材料*没入反应液后取出，37℃下染色过夜，经75%乙醇脱色后观察GUS染情况。

3. 组织PCR

   1) 1X1mm的组织，加入40 ul 0.25 N NaOH煮沸30s;

   2) 加入40 ul 0.25 N HCl和20 ul buffer ( 0.5 M Tris-HCl，pH 8.0，0.25%NP40)。

   3) 煮沸2 min，弃液体部分;

   4) 加50 ul PCR反应混合液。

4. RT-PCR分析

取野生型及转基因水稻各株系T2代叶片提取总RNA，经RNase freeDNase (Promega)处理总RNA后，各取2 ug进行反转录。分装，-20℃保存。

根据拟南芥的actin序列设计引物

Araactin 1：5'-TGGTGTCATGGTTGGGATG-3'

Araactin2：5'-CACCACTGAGCACAATGTTAC-3'

分别以引物:

P99：5'atggcgcttgcgggactttatc3'

P224：5'cagttccagtctgaccgaaagc3’

MFS：5'-CGGGGACAGATCATCA-3'

MFA：5'-CATAATGAAATGAAACTA-3’

进行RT-PCR，对目的基因AsPCSl和AsMT2a的表达水平进行检测。