国产日产欧美精品-亚洲国产综合久久精品-色综合色国产热无码一-亚洲欧美日本国产,免费观看一区二区三区_在线观看片A免费不卡观看_亚洲а∨天堂久久精品_99久无码中文字幕一本久道

豬肉中己烯雌酚殘留檢測方法－

酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法

豬肉中己烯雌酚殘留檢測方法－

酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法
 

范圍

本標準規(guī)定了豬肉中己烯雌酚殘留量檢測的制樣和酶聯(lián)免疫吸附測定法。

本標準適用于豬肉中己烯雌酚的殘留量的快速篩選檢測。對于可疑樣品需用確證法確認。

規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的版本。凡是不注日期的引用文件，其版本適用于本標準。

GB/T 1.1-2000 標準化工作導則 第1部分：標準的結構和編寫規(guī)則 (ISO/IEC Directives, Part 3, 1997, Rules for the structure and drafting of International Standards, NEQ)

GB/T 6682-1992  分析實驗室用水規(guī)則和試驗方法

農牧發(fā)[2003]1號  獸藥殘留試驗技術規(guī)范（試行）

制樣

樣品的制備

取適量新鮮或冷凍的空白或供試豬肉組織，絞碎并之使均勻，密封。

樣品的保存

-20℃以下冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/span>

測定方法

方法提要或原理

豬肉中殘留的己烯雌酚用叔丁基甲基醚提取，酶聯(lián)免疫吸附測定法測定,其基本原理是抗原抗體反應。酶標板的微孔包被有偶聯(lián)抗原，標樣或樣品中的己烯雌酚與微孔中預包被的偶聯(lián)抗原競爭己烯雌酚特抗體。通過洗滌除去沒有與特異性抗體結合的酶標記抗原。加入底物液，結合到板上的酶標記物將底物轉化為有色產物。加入終止液，在450nm處測定吸光度值，吸光度值與試樣中己烯雌酚濃度呈反比。

試劑和材料

以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純試劑；水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級水。  

叔丁基甲基醚

乙腈

正己烷

己烯雌酚試劑盒（采用*備案的試劑盒）

4.2.6.1  己烯雌酚系列標準溶液  0ng/mL 、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.1ng/mL

4.2.6.2  酶標板  8條×12孔，包被有偶聯(lián)抗原

4.2.6.3  酶標記物

4.2.6.4  己烯雌酚抗體 臨用前將抗體用稀釋了的復溶液按1：11倍稀釋（50mL抗體加500mL復溶液）成的己烯雌酚抗體溶液

4.2.6.5  底物溶液A

4.2.6.6  底物溶液B

4.2.6.7  濃縮洗滌液 臨用前用水將其稀釋20倍作為洗滌液

4.2.6.8  濃縮復溶液 臨用前用水將其稀釋5倍作為稀釋了的復溶液

4.2.6.9  終止溶液

儀器和設備

CSY-E96Y己烯雌酚殘留檢測儀

天平  感量0.01g

分析天平 感量0.00001g

漩渦混合儀

振蕩器

組織勻漿機

冷凍離心機

氮吹儀

離心管  20mL、50mL

微量移液器  單道20mL，50mL，100mL，1000mL；多道50～250mL  

測定步驟

試料的制備

試料的制備包括：

• 取絞碎后的供試樣品,作為供試試料。
• 取絞碎后的空白樣品,作為空白試料。
• 取絞碎后空白樣品,添加適宜濃度的標準溶液，作為空白添加試料。

提取和凈化

 取10000r/min勻漿1min的試料（5±0.05）g，置50mL離心管中，加15mL叔丁基甲基醚，渦旋1min，振蕩10min，6000r/min，在-4℃下離心10min，將上層清夜移至雞心瓶中。再加15mL叔丁基甲基醚同法操作，合并兩次上清液，于45℃水浴中減壓旋轉蒸發(fā)至干。

加2mL乙腈于雞心瓶中，旋渦溶解殘留物，然后將其轉移至20mL離心管中，再加2mL乙腈同法操作，轉移至同一離心管中。在離心管中加5mL正己烷，渦動60s，15℃，6000 r/min下離心5min，棄去上層液體，再加5mL正己烷于離心管中同法操作，取下層液體，60℃下氮氣吹干，加入1mL稀釋后的復溶液，渦動60s后取50mL加入200mL稀釋后的復溶液，渦動60s，即可作為試樣供分析。

樣品測定程序（20℃～26℃條件下操作）

4.4.3.1  使用前將試劑盒置于室溫（20℃～26℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的酶標板微孔條插入框架中，將不用的微孔條放入自封袋，保存于2℃～8℃。將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品均需做兩個平行實驗。

4.4.3.2  加入50 mL標準溶液或試樣溶液到微孔底部，每孔再加入50 mL己烯雌酚抗體溶液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應30min。

4.4.3.3  倒出孔中液體，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體。每孔加入250mL洗滌液，10s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復操作共洗板5次。

4.4.3.4  加入100mL酶標記物到微孔底部，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應30min。取出酶標板，如前述洗板5次。

4.4.3.5  加入50mL底物液A和50mL底物液B到微孔中，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。

4.4.3.6  加入50mL終止液到微孔中，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處，測定每孔吸光度值（OD值）。

結果計算和表述

所獲得的標準或樣品吸光度值的平均值除以*個標準（0標準）吸光度值的平均值再乘以100%，

得到以百分比給出的吸光度值，以式（1.1）表示：

百分吸光度值=        ×100%  ………………………………………………………  1.1    

式中:

B—為標準溶液或供試樣品的平均吸光度值；

B₀—為零濃度標準溶液的平均吸光度值。

以標準溶液中己烯雌酚濃度(ng/mL)的自然對數(shù)為X軸，百分吸光度值為Y軸，在半對數(shù)坐標紙上繪制標準曲線圖。相對應的供試樣品的濃度（ng/mL）可以從標準曲線上查出。也可以求出回歸曲線的方程，計算未知樣品中己烯雌酚的濃度。如果有專業(yè)計算機軟件可直接求出供試樣中己烯雌酚的濃度。

注：檢測結果小于1.0μg/ kg時，可判為未檢出，大于1.0μg/ kg時，判為可疑，需用確證法確認。

檢測方法靈敏度、準確度、精密度

靈敏度

本方法在豬肉中的zui低檢出限為1.0μg/kg。

準確度

本方法在豬肉中1.0μg/kg～4.0μg/kg添加濃度的回收率為60.0%～120.0%。

精密度

本方法的批內變異系數(shù)CV≤22%； 批間變異系數(shù)CV≤15%。

己烯雌酚殘留檢測儀技術參數(shù)：

☆波長范圍:300nm-1000nm

☆波長準確度:±2nm

☆吸光度范圍: 0.000~4.000ABS

☆分辨率 :0.001Abs

☆穩(wěn)定性 : ±0.001A/hr

☆透射比重復性: ≤0.5%T

☆光源 : 進口LED

☆樣品池 : 微孔板