单脱氢抗坏血酸还原酶（monodehydroasorbate reductase，MDHAR）

试剂盒说明书

分光光度法 50 管/48 样

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

MDHAR 催化 MDHA 还原生成 AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

测定原理：

MDHAR 催化 NADH 还原 MDHA 生成 AsA 和 NAD⁺，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰，但是 NAD⁺没有。通过测定 340 nm 光吸收下降速率，来计算出 MDHAR 活性。

实验中所需仪器及设备：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液枪和双蒸水试剂组成和配置：

试剂一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 50mL×1 瓶，室温保存。

试剂三：粉剂×1 瓶（棕色），4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水充分溶解。

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水充分溶解。

试剂五：液体 25μL×1 瓶，4℃保存。临用前加 5mL 试剂二充分溶解。

粗酶液提?。?/span>

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2. . 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建

议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；8000g ，4℃离心 20min，取上清液置冰上混匀待测。

3. 血清等液体：直接测定。

MDHAR 测定操作：

1. 分光光度计预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3. 依次在比色皿中加入 100μL 试剂三、100μL 试剂四、100μL 试剂五和 600μL 试剂二，zui后加入 100μL 上清液，迅速混匀后于 340nm 比色，记录 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2，

△A=A1-A2。

MDHAR 活性计算公式：

(1). 按蛋白浓度计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。 MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷（Cpr×V 样）÷T

= 804×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol NADH 为 1U。 MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷（W×V 样÷V 样总）÷T

= 804×△A ÷W

（3）按细胞数量计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每 10⁴ 个细胞每分钟氧化 1nmol NADH  为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T = 804×△A ÷ 细胞数量

（4）按液体体积计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫升液体每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。 MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷V 样）÷T

= 804×△A

ε：NADH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积， 1mL=0.001 L，V 样：加入反应体系中上清液体积，100μL=0.1mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量 BCA 试剂盒；V 样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：反应时间，2min。

注意事项：

    临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。

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