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柠檬酸合酶试剂盒说明书

时间:2016-9-19阅读:1432
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柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)试剂盒说明书

 

分光光度法 10 管/9 样

 

测定意义:

CSEC 2.3.3.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,是三羧酸循环*个限速酶,是三羧酸循环主要调控位点之一。

测定原理:

CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶 A,进一步水解产生柠檬酸;该反应促使无色的 DTNB 转变成黄色 TNB,在 412nm 处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制:

试剂一:液体 10mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:液体 2mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:液体 0.2mL×1 支,-20℃保存;

试剂四:液体 10mL×1 瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×1 支,4℃保存,临用前加入 320μL 蒸馏水,用不完的试剂仍 4℃保存;

试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存,临用前加入 320μL 蒸馏水,用不完的试剂仍-20℃保存;

试剂七:粉剂×1 支,-20℃保存,临用前加入 320μL 蒸馏水,用不完的试剂仍-20℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

  1. 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。 
  2. 将匀浆 600g,4℃离心 5min。 
  3. 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。 
  4. 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的 CS(此步可选做)。 
  5. 在步骤中的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),用于线粒体 CS 测定。

测定步骤:

1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 412nm,蒸馏水调零。

2、将试剂四、五、六和七在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min。

3、样本测定

试剂名称(μL

测定管

 

 

试剂四

780

 

 

试剂五

30

 

 

试剂六

30

 

 

样本

30

 

 

试剂七

30

 

 

将上述试剂按顺序加入 1 mL 玻璃比色皿中,加试剂七的同时开始计时,在 412nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1 和反应 2min 后的吸光值 A2,计算ΔA=A2-A1。

CS 活性计算:

1)按样本蛋白浓度计算:

 单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

CSU/mg prot)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

CSU/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109W× V ÷V 样总)÷T=222.2×ΔA÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

CSU/104 cell=[ΔA×V 反总÷ε×d×109500×V ÷V 样总)÷T=0.4444×ΔA V 反总:反应体系总体积,9×10-4 L;εTNB 摩尔消光系数,1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.03 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

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