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呈遞問題的解決

  在RNAi過程中，特殊的酶能將RNA切成小片段（siRNA或miRNA），并與特殊的蛋白（Argonaute蛋白，尤其是Argonaute 2（Ago2）蛋白）相結合，從而抑制靶向信使RNA翻譯。siRNA藥物可以在特定基因水平上起作用，可以遞送到胞質(zhì)溶膠中，并且不需要運輸?shù)郊毎酥谢蚺c染色體DNA相互作用。然而，正如其他DNA和RNA候選藥物一樣，siRNA藥物也正面臨著無法進行有效呈遞的問題。這些大分子會被體液中的核酸酶迅速降解，并且經(jīng)歷腎臟和肝臟的快速清除，嚴重的有可能引發(fā)不利的先天性免疫反應，想要提高siRNA藥物的療效和安全性，首要解決的就是呈遞問題。

  Jiahe Li帶領的研究團隊借助不同的傳遞載體，以RNAi的中央效應蛋白Argonaute 2（Ago2）為平臺增強RNAi。他們發(fā)現(xiàn)siRNA和Ago2之間的物理聚集對于RNAi的增強*。同時他們還發(fā)現(xiàn)某些聚胺可調(diào)節(jié)siRNA / Ago2介導的RNA，他們借此使致癌基因STAT3沉默并顯著延長了黑素瘤小鼠的存活率。該研究結果以《Structurally modulated codelivery of siRNA and Argonaute 2 for enhanced RNA interference》為題發(fā)表于2月5日的《PNAS》上。

  siRNA / Ago2進入細胞示意圖

  Li等將雙鏈siRNA和Ago2蛋白包裝到具有相同骨架但聚乙烯二胺重復不同的聚胺的陽離子側(cè)基上。研究人員發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細胞中，與其他三種Argonaute蛋白相比，Ago2顯得更為重要。在RNA誘導的基因沉默復合物形成和mRNA翻譯時，siRNA的載體鏈被切割并從Ago2分離，而反義siRNA鏈加載的Ago2卻可持續(xù)識別并切割靶mRNA。這項研究結果為改進RNAi技術功效提供了新方法。

  siRNA / Ago2引起的基因沉默

  siRNA / Ago2聚胺引起的基因沉默

  研究人員對聚胺合成的呈遞載體的設計參數(shù)和由此產(chǎn)生的siRNA / Ago2的基因沉默效率進行了研究，并合成了一系列衍生自L-天冬氨酸芐酯骨架和N-羧酸酐的聚合物，這種聚合物主鏈已被證明是相對安全的，側(cè)鏈為多胺結構，這些適當?shù)膫?cè)鏈操作不僅實現(xiàn)了率呈遞，還阻止了負面影響的產(chǎn)生。這些研究表明，再編碼的Ago2在基因沉默中發(fā)揮的重要作用，可以以不同的方式調(diào)節(jié)基因。盡管這些影響目前歸因于聚合物和siRNA以及Ago2之間的物理作用，但是這些研究結果將引導科學家對納米級效應機制的詳細研究，并對siRNA在體內(nèi)穩(wěn)定性的研究會有所幫助。另外，研究人員發(fā)現(xiàn)優(yōu)化的多胺/抗STAT3 siRNA / Ago2復合物可使腫瘤負荷降低并使小鼠存活率改善，這表明結構優(yōu)化的siRNA / Ago2具有治療的潛力。

  多胺側(cè)鏈結構穩(wěn)定了siRNA和Ago2之間的納米級相互作用

特異性問題的解決

  雖然CRISPR技術能夠達到*改造基因的效果，但在許多疾病中沉默基因會建立短期效應，其在mRNA水平上的基因表達無法*阻斷，還會減少相應的目標效應。想要準確識別這些短期效應，就需要具有*特異性的工具，解決RNAi技術的特異性問題已經(jīng)迫在眉睫。

  在3月12日一篇題為《Programmable RNA recognition using a CRISPR-associated Argonaute》的文章中，Audrone Lapinaite等人將焦點聚集于Argonaute（Ago） 蛋白上。研究人員發(fā)現(xiàn)，使用5-溴-2'-脫氧尿苷（BrdU）體外重建的CRISPR相關的Ago復合物Marinitoga piezophila Argonaute-gRNA（MpAgo RNP）可顯著增強其對RNA靶標的特異性和親和力。他們借此繪制了gRNA的種子區(qū)域，并鑒定出決定其靶向特異性的gRNA的核苷酸。

  在一些細菌中，Agos與CRISPR基因座相關，并使用非經(jīng)典的5'-羥基化的指導RNA（gRNA）進行核酸靶向。研究人員發(fā)現(xiàn)MpAgo很容易用gRNA編程來形成RNA-蛋白質(zhì)復合物（RNP）。重建的MpAgo RNPs只能以中等的親和力和特異性結合*互補的RNA底物，在gRNA的5'末端摻入5-溴-2'-脫氧尿苷（BrdU）后，使MpAgo RNP快速穩(wěn)定，并大大提高了MpAgo RNP的親和力和特異性。此外，具有5'-BrdU gRNA的MpAgo RNP可選擇性結合僅相差一個核苷酸的底物，實現(xiàn)了從復雜的混合物中分離出肌苷編輯的RNA底物。這些發(fā)現(xiàn)拓寬了研究人員對Ago與底物RNA相互作用的機理理解，并證明MpAgo RNP可以用作高度特異性的RNA靶向平臺來研究RNA。

  具有5'-BrdU gRNA的MpAgo RNP特異性結合ssRNA

gRNA的種子區(qū)域

  另外，研究人員測試了gRNA的5'端核苷酸是否影響MpAgo RNP結合和切割RNA的能力。他們使用與gRNA*互補或非互補的RNA底物，檢查了gRNA的5'-末端核苷酸是否影響體外ssRNA亞基結合效率和特異性。研究結果表明切割不需要ssRNA底物的緊密結合，gRNA的5'端核苷酸也不影響MpAgo RNP的結合能力。他們借此繪制了gRNA的種子區(qū)域，并鑒定出決定其靶向特異性的gRNA的核苷酸，順利解決了RNAi療法的特異性問題。

  3月16日，Rangaramanujam M. Kannan發(fā)表了題為《Toward new design principles for superior gene silencing》的綜述，對上述研究做了相應分析。文中指出，通過明確的設計原則，改進的siRNA包裝，可以有效解決siRNA的呈遞和Ago蛋白的特異性問題，為RNAi療法開辟新的途徑，從而實現(xiàn)個性化的藥物。

  參考資料：

  1. Structurally modulated codelivery of siRNA and Argonaute 2 for enhanced RNA interference

      2. Programmable RNA recognition using a CRISPR-associated Argonaute

      3. Toward new design principles for superior gene silencing