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流式細胞儀檢測細胞凋亡：Heochst 33342/PI雙染色法
| 方法原理 | 經固定的凋亡細胞其染色體熒光染料的DNA可染性性下降。細胞一經固定就不再是活細胞，而且細胞固定過程對細胞膜的通透性也有影響。因此發(fā)展了用“細胞活性”鑒定染料染色的流式細胞儀檢測方法。這些方法細胞不經固定就直接用DNA染料染色，且染料的濃度要比固定細胞所用的濃度要低得多。 流式細胞儀通常根據細胞膜完整性將細胞分為“活細胞”和“死細胞”，因此正常細胞和凋亡細胞歸為活細胞?；罴毎玖先鏗oechst 33342能少許進入正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高，Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度增高的機制與凋亡細胞膜通透性發(fā)生改變有關，凋亡細胞早期細胞膜的完整性沒有明顯性改變，但細胞膜的通透性已有增強，因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342比正常細胞的多。 此外，還與凋亡細胞的染色體DNA的結構發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結合以及凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細胞外使之在細胞內積累增加等有關。既然Hoechst 33342進入凋亡細胞中比正常細胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能進入細胞膜完整的活細胞中，即正常細胞和凋亡細胞在不經固定的情況下對這些染料是拒染，壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損，可被這些染料染色。 根據這些特性，用Hoechst 33342結合PI或EB等染料對凋亡細胞進行雙染色，就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區(qū)別開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，這三群細胞表現(xiàn)分別為：正常細胞為低藍色/低紅色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡細胞為高藍色/低紅色（Hoechst 33342++/PI+），壞死細胞為低藍色/高紅色（Hoechst 33342+/PI++）。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 細胞 |
| 試劑、試劑盒 | Heochst 33342 染液 PBS 蒸餾水 |
| 儀器、耗材 | 400目篩網 流式細胞儀 冰箱 |
| 實驗步驟 | 一、細胞培養(yǎng)
二、細胞收集
三、染色
四、過濾
五、流式細胞儀分析
六、結果判斷 |
| 注意事項 | 1. 在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上，還可見到細胞凋亡區(qū)向細胞壞死區(qū)遷移的軌跡，可能是凋亡細胞的DNA進一步降解的緣故。
2. 用Heochst 33342染料與細胞孵育的時間不宜過長，一般控制在20 min之內為宜。如果太長可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍光向紅光的遷移，導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變，從而影響結果的判斷。 |