您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
12
流式細(xì)胞術(shù)的常用樣品制備方法
流式細(xì)胞術(shù)的實驗檢測對象是單細(xì)胞懸液，因此，在組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)實驗中欲對待測樣品細(xì)胞進(jìn)行分類計數(shù)，也需把樣品制備成細(xì)胞懸液，并要求被檢細(xì)胞大小為0.2～80pm，每個樣品中至少有20 000個細(xì)胞，細(xì)胞濃度為105 ～107 個／ml。制備成的單細(xì)胞懸液經(jīng)熒光或免疫熒光標(biāo)記即可上機(jī)檢測。
一．單層培養(yǎng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備
1. 棄去培養(yǎng)細(xì)胞(對數(shù)生長期)中的舊培養(yǎng)液，加入1～2ml 0.25％胰蛋白酶，倒置顯微鏡下觀察，見細(xì)胞稍變圓時，停止胰蛋白酶作用。也可直接觀察培養(yǎng)瓶，靜置消化2～3分鐘，待細(xì)胞逐漸變白，有脫落趨勢時，立即豎立培養(yǎng)瓶，停止胰蛋白酶作用，棄去胰蛋白酶；
2. 加入3～4ml無鈣離子和鎂離子的PBS液，用吸管反復(fù)吹打，使其分散為單個細(xì)胞懸液，移入離心管中；
3.離心，去掉上清液，加入約0.5mlPBS液，用振蕩器使細(xì)胞分散；
4.用細(xì)滴管或注射器將細(xì)胞迅速注入4℃ 70％乙醇中，保存于4℃冰箱中備用。
二．實體組織單細(xì)胞 懸液的制備
1.機(jī)械法
①用剪刀剪碎或者用鋒利的解剖刀剁碎組織；
②將剪碎的組織加入勻漿器中勻漿；
③用吸管或注射器抽吸細(xì)胞懸液，以分散細(xì)胞；
④將細(xì)胞懸液在尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)上過濾，濾出的細(xì)胞懸液細(xì)胞計數(shù)后即可使用。
2. 酶處理法
此法是實體組織分散為單個細(xì)胞的主要方法。由于不同酶對細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間不同組分有特異消化作用，所以應(yīng)根據(jù)所用組織類型確定使用酶的種類。此外，乙二胺四乙酸(EDTA)能結(jié)合組織中的二價鈣離子和鎂離子，而二價鈣離子和鎂離子有維持細(xì)胞表面完整性和維持細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，因此，幾種酶和EDTA聯(lián)合使用有助于充分消化實體組織，提高細(xì)胞產(chǎn)出效率。下面僅介紹組織消化的一般過程，對于每種組織消化時所用的具體步驟需參考該組織細(xì)胞培養(yǎng)時的消化方法。
①將組織剪成1～2mm3左右的小塊。
②用胰蛋白酶或膠原酶消化組織塊，胰蛋白酶適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等組織。胰蛋白酶工作濃度一般為0.1％～0.5％。對于纖維較多的組織或較硬的癌組織常用0.25％膠原酶，膠原酶對組織中膠原蛋白類結(jié)構(gòu)消化作用強(qiáng)，它僅對細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對上皮細(xì)胞影響不大。膠原酶常用劑量為0.1～0.3ug／ml。用大于組織量30～50倍的胰蛋白酶液或膠原酶液在37℃條件下消化組織，需每隔一定時間搖動一次。消化時間的長短依組織類型而定，一般來說，胰蛋白酶需作用20～60分鐘，膠原酶需4～48小時。在消化過程中，如發(fā)現(xiàn)組織塊已分散而失去塊的形狀，經(jīng)搖動即可成為絮狀懸液，則可取出少量液體在顯微鏡下觀察，可見分散的單個細(xì)胞和少量的細(xì)胞團(tuán)，可認(rèn)為組織已消化充分。
③消化完畢后，將細(xì)胞懸液通過100目孔徑尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)濾過，以除掉未充分消化的組織。
④已過濾的細(xì)胞懸液經(jīng)800～1000rpm低速離心5～10分鐘后，棄上清液，加PBS液，輕輕吹打形成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后即可使用。
三．石蠟包埋組織的流式細(xì)胞樣品制備
外科手術(shù)獲得的新鮮實體組織，往往已進(jìn)行石蠟包埋處理，如果再制成細(xì)胞懸液進(jìn)行流式細(xì)胞分析，需將石蠟包埋組織進(jìn)行以下步驟的處理：
1.將石蠟包埋的組織塊切成30／xm厚的切片，盡可能除去切片中石蠟成分；
2.將切片置于離心管中，用二甲苯脫蠟2次，10分鐘／次；
3.蒸餾水洗2次后，加入1ml 1％胃蛋白酶溶液中(pH 1.5)，37℃恒溫振蕩水浴中消化30分鐘；
4.離心，所獲得的細(xì)胞沉淀可進(jìn)行染色和流式細(xì)胞術(shù)分析。