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抑菌環(huán)試驗
1 目 的
測定抗（抑）菌產(chǎn)品對細(xì)菌和真菌的抗（抑）菌作用。
2 原 理
利用抑菌劑不斷溶解經(jīng)瓊脂擴(kuò)散形成不同濃度梯度，以顯示其抑菌作用。試驗通過抑菌環(huán)大小以判斷其是否具有抑菌能力。本試驗適用于抑菌劑與溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品的抗（抑）菌效果鑒定。
3 實驗材料及器材
（1）實驗菌株 金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸桿菌（8099 或ATCC 11229）、白色念珠菌（ATCC 10231）菌懸液及根據(jù)抑菌劑特定用途所用的其他菌懸液
（2）抑菌劑載體 5mm 直徑圓形新華一號定性濾紙片，經(jīng)壓力蒸汽滅菌處理后，置 120℃ 烤干2h，保存?zhèn)溆?nbsp;
（3）活菌培養(yǎng)計數(shù)所需器材
（4）微量移液器 5μL～50μL，可調(diào)式
（5）游標(biāo)卡尺
（6）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基與沙堡瓊脂培養(yǎng)基
4 操作程序
（1）抑菌片的制備：對液體抑菌劑，取無菌并干燥的濾紙片。每片滴加實際使用濃度抑菌劑溶液 5μL，然后將濾紙片平放于清潔的無菌平皿內(nèi)，開蓋置恒溫培養(yǎng)箱（37℃）中烤干，或置室溫下自然干燥后備用。 溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品，可直接制成直徑為 5mm，厚不超過 4mm 圓片（塊），每 4 片（塊） 一組。
（2）陰性對照樣片的制備：取無菌干燥濾紙片，每片滴加無菌蒸餾水5μL，干燥后備用。 溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品的陰性對照樣本， 應(yīng)取同種材質(zhì)不含抑菌成份的樣品，制成與試驗組大小相同的樣片（塊）。
（3）試驗菌的接種：用無菌棉拭子蘸取濃度為 5×105cfu/mL～5×106cfu/mL 試驗菌懸液，在適宜的培養(yǎng)基平板表面均勻涂抹3次。每涂抹1次，平板應(yīng)轉(zhuǎn)動 60°，zui后將棉拭子繞平板邊緣涂抹一周。蓋好平皿，置室溫干燥 5min。
（4）抑菌劑樣片貼放：每次試驗貼放1個染菌平板，每個平板貼放4片試驗樣片， 1 片陰性對照樣片，共 5 片。用無菌鑷子取樣片貼放于平板表面。各樣片中心之間相距 25mm 以上， 與平板的周緣相距 15mm 以上。貼放好后，用無菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。蓋好平皿，置 37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng) 16h～18h 觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)的直徑（包括貼片）并記錄。
（5）試驗重復(fù)3次。
（6）測量抑菌環(huán)時，應(yīng)選均勻而*無菌生長的抑菌環(huán)進(jìn)行。測量其直徑應(yīng)以抑菌環(huán)外沿為界。 4
5 評價規(guī)定
（1）抑菌作用的判斷：
抑菌環(huán)直徑大于 7mm 者，判為有抑菌作用。 抑菌環(huán)直徑小于或等于 7mm 者，判為無抑菌作用。
（2）3 次重復(fù)試驗（共12個樣片）均有抑菌作用結(jié)果者，判為合格。
（3）陰性對照組應(yīng)無抑菌環(huán)產(chǎn)生。否則試驗無效。
6 注意事項
（1）每次試驗均應(yīng)設(shè)置陰性對照。在報告中亦必須將對照組的結(jié)果列出。
（2）接種用細(xì)菌懸液的濃度應(yīng)符合要求。濃度過低，接種菌量少，抑菌環(huán)常因之增大；濃度過高，接種量過多，抑菌環(huán)則可減小。
（3）應(yīng)保持瓊脂濃度的準(zhǔn)確性，否則可影響抑菌環(huán)的大小。
（4）培養(yǎng)時間不得超過 18h。培養(yǎng)過久，部分細(xì)菌可恢復(fù)生長，抑菌環(huán)變小。
（5）抑菌環(huán)直徑可受抑菌劑的量、抑菌性能和干濕度影響。故抑菌劑濾紙片應(yīng)在試驗當(dāng)天制備。