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Fish探針標(biāo)記方法大全
1、DNA的缺口平移法
缺口平移是一種快速、簡便、成本相對(duì)較低以及生產(chǎn)高比活性均一標(biāo)記DNA的方法。該技術(shù)可以制備序列特異的探針。當(dāng)使用重組質(zhì)粒探針時(shí)，雖然任何形式的雙鏈DNA都可以進(jìn)行缺口平移標(biāo)記。但通常使用限制性核酸內(nèi)切酶將插入片段進(jìn)行酶切和凝膠電泳純化后再進(jìn)行缺口平移標(biāo)記。此外，用這種探針進(jìn)行雜交可產(chǎn)生較低的背景信號(hào)。
2、DNA的隨機(jī)引物法
這種方法是使用寡核苷酸引物和大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段來標(biāo)記DNA pian段。這種方法可代替缺口平移產(chǎn)生均一的標(biāo)記探針外，還在許多方面優(yōu)于缺口平移法，比如標(biāo)記核苷酸在DNA探針中的摻入率可達(dá)50％以上。由于在反應(yīng)過程中加入的DNA pian段不被降解，故在隨機(jī)引物反應(yīng)中加入的DNA可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地標(biāo)記。DNA pian段的大小不影響標(biāo)記的結(jié)果。標(biāo)記物沿所加入的全長DNA被均等地?fù)饺?。?biāo)記的探針可以直接使用而不需要去除未摻入的核苷酸；單鏈雙鏈DNA都可作為隨機(jī)引物標(biāo)記的模版。隨機(jī)引物可用于較小的DNA pian段（100~500 bp），而缺口平移法對(duì)大DNA pian段（>1000 bp）效果。隨機(jī)引物法的主要缺點(diǎn)是產(chǎn)生的標(biāo)記探針量比缺口平移的要少些，此外環(huán)狀DNA不能有效地標(biāo)記，必須先用限制性內(nèi)切核酸酶線形化或用堿法或DNA酶Ⅰ產(chǎn)生缺口。
3、RNA的體外轉(zhuǎn)錄法
體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記RNA探針可用于商品化轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒來制備。這些質(zhì)粒中應(yīng)該包括SP6、T3、或T7 RNA聚合酶的RNA啟動(dòng)位點(diǎn)和，而這些啟動(dòng)位點(diǎn)則與多克隆位點(diǎn)（multiple cloning sites，MCS）相鄰。
4、RNA的寡脫氧核苷酸法
克隆質(zhì)粒pSP64、pGEM-3、pGEM-4等含鄰近MCS的SP6RNA啟動(dòng)子，可作為從DNA寡核苷酸模版產(chǎn)生RNA探針的基礎(chǔ)。這兩種標(biāo)記方法產(chǎn)生探針量大，而且產(chǎn)生的探針不受載體序列的影響，所需要的線性化的質(zhì)粒DNA大約1 ug，但需要高純度的模板。
5、寡核苷酸的“接尾法”
末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶可將三磷酸脫氧核苷加到DNA分子游離的3’-OH末端。這種脫氧核苷酸連接將在探針3’末端形成一個(gè)延伸的“尾巴”。用這種方法可加上許多基因以產(chǎn)生高比活性的探針，適用于基因庫中克隆序列的鑒定，基因組DNA樣品的點(diǎn)突變檢測和原位雜交。
6、5’端寡核苷酸的T4多聚核苷酸激酶法
T4多聚核苷酸激酶可將γ-32P-ATP的γ-磷轉(zhuǎn)移到游離的5’-OH端上。合成寡脫氧核糖核苷酸時(shí)，它們通常未被磷酸化，因而在5’端應(yīng)含有一個(gè)羥基。由于探針分子只摻入了一個(gè)同位素分子，故探針活性與其長度有關(guān)。短寡核苷酸可被高比活性標(biāo)記，而較長的探針活性則隨其長度增加而降低。這種激酶標(biāo)記方法zui常用于DNA序列測定。
7、聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)記法
聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）用于標(biāo)記比活性DNA pian段，這種技術(shù)具有很高的特異性，可以在1~2 h之內(nèi)大量合成探針DNA pian段，標(biāo)記物的摻入率可高達(dá)70％~80％。因此，PCR標(biāo)記技術(shù)特別適用于大規(guī)模檢測和非放射性標(biāo)記。該方法的缺點(diǎn)是需要合成一對(duì)特異性PCR引物。使用從探針DNA上制備的小片段引物也能取得較好的標(biāo)記效果。
一般來說，核酸探針的檢測方法應(yīng)根據(jù)核酸探針的標(biāo)記物來決定。放射性同位素可通過放射自顯影而使其標(biāo)記的核酸探針得到檢測。下面為非放射性標(biāo)記探針的檢測：①堿性磷酸酶（AKP）顯示系統(tǒng)。ASO-AKP + BCIP（pH9.5）→ BCl-OH + Pi；BCl-OH + NBT → 紫色。此系統(tǒng)中核酸探針以AKP為標(biāo)記物。ASO：等位基因特異的寡核苷酸，BCIP：5-溴-4氯-3-吲哚磷酸，NBT：四氮唑藍(lán)，Pi：磷酸。②辣根過氧化物酶（HRP）顯示系統(tǒng)。HRP + H2O2 → [HRP: H2O2 ]；ODA-NH2 + [HRP: H2O2 ] → ODA-N = ODA/棕色 + HRP + H2O。此系統(tǒng)的核酸探針以HRP為標(biāo)記物。ODA：鄰-聯(lián)茴香胺。③ABC顯示系統(tǒng)。DNA-B + SA-酶 → DNA-B-SA 或DNA-B + SA-生物素化的酶 → DNA-B-SA-生物素化的酶。此系統(tǒng)的核酸探針以生物素（biotin，B）為標(biāo)記物，然后利用親和素（avidin，A）、生物素以及酶三者形成的復(fù)合物（complex，C）在該酶的顯色反應(yīng)下以完成對(duì)核酸探針的檢測。SA：streptavidin-鏈酶親合素，ABC即為avidin-biotin-enzyme complex-親合素-生物素-酶復(fù)合物。酶可選用AKP或HRP，然后以各自的酶顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯示。