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慢病毒感染目的細(xì)胞實驗步驟
1. 感染預(yù)實驗
以 24 孔培養(yǎng)板為例，同時進(jìn)行目的細(xì)胞和工具細(xì)胞的感染預(yù)實驗。工具細(xì)胞可選擇 293T（人胚腎上皮細(xì)胞）、H1299（人肺癌細(xì)胞）或其它細(xì)胞。實驗材料：培養(yǎng)基、24 孔培養(yǎng)板，移液槍，槍頭， EP 管，細(xì)胞計數(shù)板、冰盒、廢液缸等。（根據(jù)目的細(xì)胞情況，可酌情使用 Polybrene）
Day1：
準(zhǔn)備細(xì)胞：培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期，細(xì)胞以胰酶消化計數(shù)后，用細(xì)胞計數(shù)測出細(xì)胞密度，每孔接種 5×104 個細(xì)胞，添加細(xì)胞培養(yǎng)液至 500µL。通常情況下，該接種量的 H1299 或 293T 細(xì)胞在感染后第 3 天可生長至 80%-90% 融合度。（接種目的細(xì)胞時，請根據(jù)細(xì)胞的實際生長速度調(diào)整接種量，使目的細(xì)胞感染后第 3 天生長至 80%-90% 融合度）
Day2：
（1）準(zhǔn)備慢病毒顆粒：計算所需慢病毒顆粒的量，將凍存在 -80℃ 的慢病毒顆粒取出，冰浴融化；
（2）感染目的細(xì)胞：從培養(yǎng)箱中拿出細(xì)胞，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及細(xì)胞融合度；如細(xì)胞狀態(tài)較好，則開始實驗：
A. 用移液槍小心吸去 24 孔板中的舊培養(yǎng)液，加入新的*培養(yǎng)液；
B. 在細(xì)胞中分別加入計算好的慢病毒顆粒液，將培養(yǎng)板平置于工作臺上，以劃 8 字的方式輕柔混勻；
C. 混勻后，細(xì)胞培養(yǎng)板置于 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)。
Day3：
更換培養(yǎng)液：感染 12-16 小時后，吸出含慢病毒顆粒的培養(yǎng)液，重新向培養(yǎng)板添加含 5% 滅活 FBS（胎牛血清）的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。（目的細(xì)胞需要調(diào)整感染時長，部分細(xì)胞不可感染超過 12 小時。）
Day4：
繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞狀態(tài)是否有異常。
Day5：
觀察（評估）慢病毒顆粒感染效率：蓋緊 24 孔培養(yǎng)板，使用 70% 乙醇清理培養(yǎng)板外壁，在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，拍照并估計慢病毒顆粒對細(xì)胞的感染效率。（如果慢病毒顆粒攜帶的基因表達(dá)所需的時間較長，熒光表達(dá)所需時間也較長，建議感染 72、96 小時后觀測熒光表達(dá)。）
根據(jù)熒光情況，可以初步從 MOI 梯度摸索實驗中，找出目的細(xì)胞的 MOI 值。
圖 1. H1299 細(xì)胞的 MOI 梯度摸索結(jié)果示例
示例中使用的慢病毒顆粒是 LPP-eGFP-Lv105（滴度 1×10 8TU/mL），曝光時間 1s，顯微倍數(shù) 100×。從上圖可見第 2 組細(xì)胞的感染效率已達(dá)到 90%。由于慢病毒顆粒對細(xì)胞有一定毒性，當(dāng) MOI 值過高時，繼續(xù)添加慢病毒顆粒，感染效率沒有明顯增加，且細(xì)胞狀態(tài)容易變差、皺縮甚至死亡。
熒光報告基因和目的基因的相對表達(dá)并不總是成等比關(guān)系的。在有的情況下，即使熒光報告基因表達(dá)較低或無表達(dá)，目的基因依然能夠表達(dá)；反之亦然。所以在觀察熒光效果后，建議使用 qRT-PCR 作進(jìn)一步鑒定。
圖 2. 293T 細(xì)胞的 MOI 梯度摸索結(jié)果示例
示例中使用的慢病毒顆粒是 LPP-eGFP-Lv105（滴度 1×108TU/mL），曝光時間 0.6s，顯微倍數(shù) 100×。從上圖可見第 2 組細(xì)胞的感染效率已達(dá)到 80%。由于慢病毒顆粒對細(xì)胞有一定毒性，當(dāng) MOI 值過高時，繼續(xù)添加慢病毒顆粒，感染效率沒有明顯增加，且細(xì)胞狀態(tài)容易變差、皺縮甚至死亡。
2. 摸索細(xì)胞的zui適藥物篩選濃度
細(xì)胞的種類與狀態(tài)均會影響慢病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，部分細(xì)胞可能與慢病毒顆粒有相互抵抗的現(xiàn)象，導(dǎo)致感染效率低。當(dāng)您在感染后 72、96 小時后發(fā)現(xiàn)感染效果仍不理想，建議對感染后的細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選（藥篩），以收集較多感染成功的細(xì)胞。
慢病毒顆粒攜帶的基因整合到目的細(xì)胞基因組是隨機(jī)發(fā)生的非同源性重組，當(dāng)抗性基因表達(dá)時，目的基因不一定也能表達(dá)，在進(jìn)行藥篩處理后，還要以 qRT-PCR 作進(jìn)一步鑒定。
在進(jìn)行正式的抗生素篩選前，建議您先對空白細(xì)胞的zui小致死濃度進(jìn)行摸索、優(yōu)化。
表 4. 抗生素篩選細(xì)胞的相關(guān)參考值
以 293T 細(xì)胞+Puromycin 為例，從相關(guān)文獻(xiàn)查得 Puromycin 對 293T 細(xì)胞的zui小致死濃度為 2 µg/mL。在 2 µg/mL 附件多設(shè)置幾個濃度梯度，可以得出較的的篩選濃度。
（1）準(zhǔn)備 24 孔培養(yǎng)板，按每孔 1-5×104 細(xì)胞數(shù) (約等于 20%-35% 融合度) 接種 293T 空白細(xì)胞，對其中 6 個孔進(jìn)行鋪板；
（2）一般 Puromycin 母液的濃度是 10 mg/mL，用細(xì)胞培養(yǎng)基將 Puromycin 母液稀釋 1000 倍，可獲得終濃度為 10 µg/mL 的 Puromycin 稀釋液；
（3）按表 5 所示，每孔添加相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基和 Puromycin；
（4）24 孔培養(yǎng)板置于 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱，培養(yǎng)過夜；
（5）按表 4 的藥篩時間和觀察時間建議，定期在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。
當(dāng)空白細(xì)胞剛好能全部死亡時，該濃度的抗生素可作為zui適藥篩濃度。
表 5. 藥物篩選濃度梯度參考（Puromycin）
* 表格中使用的 Puromycin 濃度為 10 µg/mL，是由 10 mg/mL 的 Puromycin 母液以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋 1000 倍所得。
注：以上表格的設(shè)置僅供參考。通常即使細(xì)胞一樣，由于培養(yǎng)的條件和傳代次數(shù)不一樣，篩選濃度亦不一樣?？筛鶕?jù)試驗結(jié)果進(jìn)行更進(jìn)一步的細(xì)化濃度梯度設(shè)置。 如果藥篩過程中細(xì)胞量較少，為保持細(xì)胞的數(shù)一定，一般不換液，只有在穩(wěn)轉(zhuǎn)株藥篩過程中，根據(jù)細(xì)胞生長速度，3-4 天換液一次。
如果目的細(xì)胞較難感染，一次感染不能達(dá)到預(yù)期效果時，在感染 3 天后可對目的細(xì)胞進(jìn)行藥篩處理，獲得較多被感染的細(xì)胞，如以下例子所示：
圖 3. 人食管癌細(xì)胞 CE-81T（貼壁細(xì)胞）的藥篩前后效果對比
圖 4. 人骨肉瘤細(xì)胞 Hos（貼壁細(xì)胞）的藥篩前后效果對比
圖 5. 人白血病 K562（懸浮細(xì)胞）的藥篩前后效果對比
附：細(xì)胞融合度參考
圖 6. 293T 細(xì)胞在不同融合度的明視野效果（放大倍數(shù)：100×）
3. 實驗體系的放大和正式實驗
根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，放大慢病毒顆粒細(xì)胞感染實驗，實施正式實驗。
通過慢病毒顆粒感染細(xì)胞的預(yù)實驗，我們大致獲得慢病毒顆粒感染目的細(xì)胞的優(yōu)化條件。正式實驗所用的細(xì)胞數(shù)往往比預(yù)實驗多，慢病毒顆粒用量也需要適當(dāng)放大。放大原則是保持細(xì)胞密度一致，按實際細(xì)胞數(shù)與預(yù)實驗細(xì)胞數(shù)的比例放大培養(yǎng)液體積和慢病毒顆粒用量。有兩種放大方法可供參考：
按底面積放大（適用于貼壁細(xì)胞）
當(dāng)細(xì)胞的密度不變時，細(xì)胞總數(shù)和底面積成正比，且 MOI 不變，所需慢病毒顆粒用量也和底面積成正比。假設(shè)預(yù)實驗使用 96 孔板（底面積 0.3 cm2），使用 1 μL 慢病毒顆粒（滴度 1×108 TU/mL）可成功感染細(xì)胞；如正式實驗使用 6 孔板（底面積 10 cm2），則：
底面積的放大倍數(shù) ≈ 33
正式的慢病毒顆粒用量 = 預(yù)實驗用量×33 = 33 μL 慢病毒顆粒（滴度 1×108 TU/mL）
注：請確保細(xì)胞均勻、單層分布，不成簇生長。
按培養(yǎng)體積放大（適用于懸浮細(xì)胞）
當(dāng)細(xì)胞的密度不變時，細(xì)胞總數(shù)和感染體積成正比，且 MOI 不變，所需慢病毒顆粒用量也和培養(yǎng)液體積成正比。假設(shè)預(yù)實驗使用 96 孔板（培養(yǎng)體積 100μL），使用 1 μL 慢病毒（滴度 1×108 TU/mL）可成功感染細(xì)胞；如正式實驗使用 6 孔板（培養(yǎng)體積 2 mL），則：
培養(yǎng)體積的放大倍數(shù) = 20
正式的慢病毒顆粒用量 = 預(yù)實驗用量×20 = 20 μL 慢病毒顆粒（滴度 1×108 TU/mL）
注：請確保細(xì)胞生長狀態(tài)良好。