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冷凍干燥與液氮保藏菌種技術(shù)
建議用下列方法恢復(fù)培養(yǎng)冷凍干燥保藏的菌種。
一、安瓶管開封 ：
1.用浸過70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管。
2.用火焰將安瓿管頂端加熱。
3.滴無(wú)菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂。
4.用挫刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。
二、菌株恢復(fù)培養(yǎng) ：
1.用無(wú)菌吸管，吸取0.3～0.5ml適宜的液體培養(yǎng)基，滴人安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍于菌體溶解呈懸浮狀。
2.取0.1～0.2ml菌體懸浮液，移植于適宜的瓊脂斜面/平板培養(yǎng)基上，剩余的菌液，注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi)，然后在建議的溫度下培養(yǎng)。
3.若未能活化，或活化后有疑問時(shí)，請(qǐng)于收到菌種1個(gè)月內(nèi)，通知保藏中心，經(jīng)查證無(wú)誤后，即免費(fèi)補(bǔ)寄。
三、注意事項(xiàng) ：
1.菌種活化前，請(qǐng)將安瓿管保存在6一10℃的環(huán)境下。
2.厭氧菌的培養(yǎng)，如無(wú)特別說(shuō)明，自開封至接種完成，均需以無(wú)氧氣體充填，以保持厭氧狀態(tài)。
3.某些菌種經(jīng)過冷凍干燥保存后，延遲期較長(zhǎng)，需連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長(zhǎng)，此時(shí)請(qǐng)將步驟二(2)重復(fù)一次。
< 液氮超低溫保藏程序 >
1、容器的選擇：使用帶螺旋蓋的2ml塑料安培瓶。
2、檢查安培瓶是否滲漏：用0.05%的亞甲基藍(lán)水溶液在4℃浸泡30-45分鐘，沖洗干凈，棄去含有藍(lán)色染料的安培瓶，其余的安培瓶備用。
3、打印標(biāo)簽(激光打印)。
4、容器的滅菌：先用蒸餾水漂洗干凈安培瓶，再用蒸餾水在滅菌鍋中121℃浸泡滅菌15分鐘，干燥并將打印好的標(biāo)簽放入安培瓶中，略擰緊螺旋蓋，再行121℃滅菌30分鐘。
5、保藏菌菌齡：處于zui大生長(zhǎng)量階段或?qū)?shù)生長(zhǎng)期后期。
6、保護(hù)劑：選用5-10%的甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑。
1)甘油的準(zhǔn)備：在121℃滅菌15分鐘，2-8℃貯存。甘油一般以兩倍zui終所需濃度的水溶液保存，然后與同等量的細(xì)胞懸液混合。若不用細(xì)胞懸液，則以zui終所需濃度的水溶液保存。
2)二甲基亞砜：用0.22um的聚四氟乙烯過濾膜過濾除菌。過濾膜預(yù)先用甲醇和二甲基亞砜漂洗。無(wú)菌的二甲基亞砜以10-15ml裝量2-8℃避光保存。
7、分裝：在無(wú)菌條件下，將細(xì)胞懸液(從平板上打下直徑為5cm的菌塊)分裝于安培瓶中，并注入保護(hù)劑，擰緊螺旋蓋。 傳代細(xì)胞
8、將安培瓶固定在鋁夾上，貼好標(biāo)簽。為了便于取用，一般一個(gè)鋁夾上僅放一個(gè)菌株。
9、將控溫系統(tǒng)先預(yù)冷到4℃，再將鋁夾放入其中。以每分鐘1℃降溫至-40℃，然后以每分鐘10℃降溫至-90℃。降溫以后，將鋁夾轉(zhuǎn)移至處于液氮中的儲(chǔ)存器中保存。
10、菌種的復(fù)活：將液氮保藏的菌種取出，迅速放入37℃水浴中解凍。一般需2至2.5分鐘,等*解凍后，再及時(shí)轉(zhuǎn)接到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
一、安瓶管開封 ：
1.用浸過70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管。
2.用火焰將安瓿管頂端加熱。
3.滴無(wú)菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂。
4.用挫刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。
二、菌株恢復(fù)培養(yǎng) ：
1.用無(wú)菌吸管，吸取0.3～0.5ml適宜的液體培養(yǎng)基，滴人安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍于菌體溶解呈懸浮狀。
2.取0.1～0.2ml菌體懸浮液，移植于適宜的瓊脂斜面/平板培養(yǎng)基上，剩余的菌液，注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi)，然后在建議的溫度下培養(yǎng)。
3.若未能活化，或活化后有疑問時(shí)，請(qǐng)于收到菌種1個(gè)月內(nèi)，通知保藏中心，經(jīng)查證無(wú)誤后，即免費(fèi)補(bǔ)寄。
三、注意事項(xiàng) ：
1.菌種活化前，請(qǐng)將安瓿管保存在6一10℃的環(huán)境下。
2.厭氧菌的培養(yǎng)，如無(wú)特別說(shuō)明，自開封至接種完成，均需以無(wú)氧氣體充填，以保持厭氧狀態(tài)。
3.某些菌種經(jīng)過冷凍干燥保存后，延遲期較長(zhǎng)，需連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長(zhǎng)，此時(shí)請(qǐng)將步驟二(2)重復(fù)一次。
< 液氮超低溫保藏程序 >
1、容器的選擇：使用帶螺旋蓋的2ml塑料安培瓶。
2、檢查安培瓶是否滲漏：用0.05%的亞甲基藍(lán)水溶液在4℃浸泡30-45分鐘，沖洗干凈，棄去含有藍(lán)色染料的安培瓶，其余的安培瓶備用。
3、打印標(biāo)簽(激光打印)。
4、容器的滅菌：先用蒸餾水漂洗干凈安培瓶，再用蒸餾水在滅菌鍋中121℃浸泡滅菌15分鐘，干燥并將打印好的標(biāo)簽放入安培瓶中，略擰緊螺旋蓋，再行121℃滅菌30分鐘。
5、保藏菌菌齡：處于zui大生長(zhǎng)量階段或?qū)?shù)生長(zhǎng)期后期。
6、保護(hù)劑：選用5-10%的甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑。
1)甘油的準(zhǔn)備：在121℃滅菌15分鐘，2-8℃貯存。甘油一般以兩倍zui終所需濃度的水溶液保存，然后與同等量的細(xì)胞懸液混合。若不用細(xì)胞懸液，則以zui終所需濃度的水溶液保存。
2)二甲基亞砜：用0.22um的聚四氟乙烯過濾膜過濾除菌。過濾膜預(yù)先用甲醇和二甲基亞砜漂洗。無(wú)菌的二甲基亞砜以10-15ml裝量2-8℃避光保存。
7、分裝：在無(wú)菌條件下，將細(xì)胞懸液(從平板上打下直徑為5cm的菌塊)分裝于安培瓶中，并注入保護(hù)劑，擰緊螺旋蓋。 傳代細(xì)胞
8、將安培瓶固定在鋁夾上，貼好標(biāo)簽。為了便于取用，一般一個(gè)鋁夾上僅放一個(gè)菌株。
9、將控溫系統(tǒng)先預(yù)冷到4℃，再將鋁夾放入其中。以每分鐘1℃降溫至-40℃，然后以每分鐘10℃降溫至-90℃。降溫以后，將鋁夾轉(zhuǎn)移至處于液氮中的儲(chǔ)存器中保存。
10、菌種的復(fù)活：將液氮保藏的菌種取出，迅速放入37℃水浴中解凍。一般需2至2.5分鐘,等*解凍后，再及時(shí)轉(zhuǎn)接到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。