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重組膠原蛋白：凱氏定氮、高效液相色譜雙法解疑
前言
最近，知名美妝護膚品牌卷入成分爭議風(fēng)波。有博主質(zhì)疑稱該品牌一款重組膠原蛋白精華的產(chǎn)品涉嫌造假，重組膠原蛋白真實添加量為0.0177%，且未檢測出膠原蛋白的核心氨基酸成分——甘氨酸。該公司聲明，產(chǎn)品成分標(biāo)注均按法定標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行并通過藥監(jiān)部門審核備案，不存在任何成分造假或隱瞞行為。雙方爭論的核心還在于檢測方法的不同。
重組膠原蛋白作為生物醫(yī)藥與護膚領(lǐng)域的高效活性原料，其真蛋白含量直接決定產(chǎn)品的功效與質(zhì)量，且氨基酸作為基本組成單元構(gòu)成重組膠原蛋白的鏈狀結(jié)構(gòu)，其特定序列與修飾（如羥脯氨酸）直接決定其三螺旋穩(wěn)定性及生物學(xué)功能。本文使用“凱氏定氮法"檢測重組膠原蛋白中的總氮、非蛋白氮及真蛋白含量，并使用“高效液相色譜法"檢測重組膠原蛋白中的氨基酸含量，為廣大生產(chǎn)企業(yè)、第三方檢測機構(gòu)及監(jiān)管部門提供支持。
凱氏定氮法
根據(jù)《YY/T 1947-2025 重組膠原蛋白敷料》中要求，重組膠原蛋白含量可按照《中華人民共和國藥典》(2020年版 四部)通則0731蛋白質(zhì)含量測定法的“凱氏定氮法"進行測定，采用鎢酸鈉沉降法沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，通過差減法減去樣品中非蛋白氮含量，從而得到真蛋白含量。
實驗方案
儀器
海能K1160全自動凱氏定氮儀、SH420F石墨消解儀、分析天平等。
試劑
甲基紅、溴甲酚綠、硼酸、氫氧化鈉、無水硫酸鉀、五水合硫酸銅、濃硫酸、鎢酸鈉。
樣品
重組膠原蛋白修復(fù)液。
實驗過程
試劑配制完成后，進行樣品稱量。
樣品稱量
1、總氮含量測試：通過減量法準(zhǔn)確稱取樣品5 g左右（精確至0.1 mg），并轉(zhuǎn)移至潔凈的消化管中。
2、非蛋白氮含量測試：通過減量法準(zhǔn)確稱取樣品5 g左右（精確至0.1 mg），置于20 mL容量瓶中，加入10 mL的純水、2 mL的10%鎢酸鈉溶液和2 mL的0.33 mol/L硫酸溶液，加水定容至刻度。搖勻，靜置30分鐘后，于3000 rpm下離心5 min以促進樣品過濾。隨后取上清液進行過濾，棄去初濾液（約5滴），取續(xù)濾液，使用10 mL移液管準(zhǔn)確量取10 mL濾液于消化管中待測。空白消化管中則需加入8 mL的純水、1 mL的10%鎢酸鈉溶液和1 mL的0.33 mo1/L硫酸溶液。
消解
向空白及樣品消化管中加入0.2 g硫酸銅、3 g硫酸鉀和10 mL濃硫酸后上機消解。消解程序如表1：
表1 SH420F石墨消解儀消解程序設(shè)置
階梯 | 溫度梯度/℃ | 保溫時間/min |
1 | 220 | 20 |
2 | 420 | 90 |
蒸餾與滴定
待消解程序完成，消化管冷卻并無酸霧后，使用凱氏定氮儀進行檢測，定氮儀參數(shù)設(shè)置如表2：
表2 K1160全自動凱氏定氮儀試驗參數(shù)設(shè)置
滴定酸 (H+) mol/L | 0.0207 |
硼酸/mL | 30 |
氫氧化鈉/mL | 40 |
稀釋水/mL | 40 |
蒸餾時間/min | 5 |
測試結(jié)果
樣品經(jīng)消解和上機測試，重組膠原蛋白產(chǎn)品中總氮、非蛋白氮及真蛋白含量如表3至表5所示：
表3 樣品中總氮含量表
樣品 名稱 | 稱樣量 /g | 空白體積 /mL | 滴定體積 /mL | 氮含量 （mg/g） | 氮含量均值 （mg/g） |
修復(fù)液 | 5.0482 | 0.1949 | 5.9730 | 0.3317 | 0.3348 |
5.0104 | 6.0374 | 0.3379 |
表4 樣品中非蛋白氮含量表
樣品 名稱 | 稱樣量 /g | 空白體積 /mL | 滴定體積 /mL | 非蛋白 氮含量 （mg/g） | 非蛋白氮 含量均值 （mg/g） |
修復(fù)液 | 5.1384 | 0.2035 | 1.2107 | 0.1136 | 0.1118 |
5.0509 | 1.1622 | 0.1100 |
表5 樣品中真蛋白含量表
樣品 名稱 | 總氮含量 （mg/g） | 非蛋白氮含量 （mg/g） | 真蛋白含量 （mg/g） |
修復(fù)液 | 0.3348 | 0.1118 | 1.1306 |
注：表中真蛋白含量=（樣品總氮含量-非蛋白氮含量）×蛋白轉(zhuǎn)換系數(shù)（5.07）。
結(jié)論
經(jīng)測試，重組膠原蛋白產(chǎn)品中的總氮、非蛋白氮和真蛋白含量分別為0.3348 mg/g、0.1118 mg/g和1.1306 mg/g。實驗結(jié)果表明，凱氏定氮儀可用于檢測重組膠原蛋白產(chǎn)品中的真蛋白含量。
高效液相色譜法
高效液相色譜法檢測氨基酸時，因氨基酸自身無紫外吸收基團，需借助異硫氰酸苯酯（PITC）、鄰苯二甲醛（OPA）、丹磺酰氯（DNSCl）、2,4-二硝基氟苯（DNFB）等柱前衍生試劑引入生色基團，使衍生物具備紫外吸收特性以便被檢測。異硫氰苯酯（PITC）作為氨基酸分析中的經(jīng)典柱前衍生試劑，通過與氨基酸的α-氨基特異性反應(yīng)生成穩(wěn)定的苯基硫代氨基甲酰（PTC）衍生物，該衍生物具有強紫外吸收特性（λmax=254nm），可顯著提升檢測靈敏度至皮摩爾級，同時其反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物穩(wěn)定性高且能兼容多數(shù)氨基酸（包括含羥基或含硫氨基酸），使其在高效液相色譜分析中成為兼顧靈敏度、選擇性與操作便捷性的理想選擇。本實驗采用PITC柱前衍生-高效液相色譜法檢測重組膠原蛋白中的16種氨基酸。
實驗方案
儀器配置
悟空K2025高效液相色譜儀：K2025 P2二元高壓輸液泵、K2025 AS自動進樣器、K2025 CO柱溫箱、K2025 UVD紫外-可見光檢測器、Wookinglab色譜工作站。
色譜條件：
色譜柱：JinGuBang AAA ，4.6×250 mm，5 μm；
流動相：流動相A為0.05 mol/L乙酸鈉水溶液，流動相B為甲醇-乙腈-水=1:3:1，梯度洗脫如下表：
時間 （min） | 流速 （mL/min） | 流動相A （%） | 流動相B （%） |
0.0 | 1.0 | 95 | 5 |
39.0 | 1.0 | 52 | 48 |
40.0 | 1.0 | 0 | 100 |
45.0 | 1.0 | 0 | 100 |
46.0 | 1.0 | 95 | 5 |
60.0 | 1.0 | 95 | 5 |
進樣量：20 μL；
洗針液：90%甲醇水溶液；
柱溫：40℃；
檢測器及檢測波長：檢測器為紫外-可見光檢測器，檢測波長為254 nm。
實驗結(jié)果
1、線性范圍結(jié)果
按照色譜條件進行采集，16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示，積分結(jié)果如表1所示。
圖1 16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖
表1 16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖積分結(jié)果
由表1中數(shù)據(jù)可知，16種氨基酸峰的理論塔板數(shù)范圍為12333~397824，分離度范圍為1.14~29.62，均可實現(xiàn)較好分離。
按照色譜條件進行采集，將16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機測定，16種氨基酸在0.0625 μmol/mL~1.25 μmol/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，確定系數(shù)R2的范圍為0.9976 ~0.9999 。16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液疊加的色譜圖如圖2所示。
圖2 16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液疊加色譜圖
結(jié)論
本實驗采用PITC柱前衍生-高效液相色譜法成功實現(xiàn)了重組膠原蛋白中16種氨基酸的檢測。
膠原蛋白含量的檢測方法多樣，具體選擇取決于樣本類型、設(shè)備條件等，可根據(jù)實驗室條件和需求選擇合適方法，必要時可結(jié)合多種技術(shù)驗證結(jié)果。
