细胞传代的操作步骤

细胞传代是指去除原培养基，将细胞从原培养体系转移到新鲜的生长培养基中，目的是使细胞得到进一步增殖。依据细胞是否贴壁生长，又分成贴壁细胞传代和悬浮细胞传代。下面分别介绍这2种生长类型的细胞具体传代步骤。

贴壁细胞传代
贴壁细胞需要用到一种特定的试剂——蛋白酶，其作用是切断细胞和容器之间，细胞与细胞之间的相互粘连，用蛋白酶处理细胞的过程叫做“消化”，“消化”之后的下拨会形成单细胞并从容器底部掉下来。常用的蛋白酶是胰蛋白酶。

材料准备：

1、预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热；

2、用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手；

3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且减少污染；

4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

传代流程：

1. 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

2. 从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。

3. 将培养瓶放入超净工作台后打开瓶口，同时要在酒精灯上烧口消毒。

4. 加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞较好好，消化温度是37℃。

5. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。

6. 弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液终止反应。小心吹打成细胞悬液。

7. 将细胞悬液吸入10 ml离心管中。平衡后将离心管放入离心机中，以1000 rpm/min离心5 min。

8. 弃去上清液，加入适当体积的培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

9. 将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

10. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。后要做好标记。

11. 继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2-4 h后开始贴附在瓶壁上。

2. 悬浮细胞传代

由于细胞已经在生长培养基中悬浮，所以无需酶的作用使其从培养容器表面脱离，方法简单。通常有两种方法。

材料准备：

1、装有悬浮细胞的培养容器。

2、*生长培养基，预热至37℃

3、37℃培养箱，充有二氧化碳浓度为5%的湿化空气。

传代流程：

一、直接传代法

① 待悬浮细胞长满至80%~90%（细胞悬液变黄），即可传代；

② 用吸管吸弃细胞悬液1/2~1/3；

③ 加入适量的新鲜培养基，继续培养。

二、离心传代法（在发现有细胞碎片的情况下）

① 将细胞悬液转移到离心管内；

② 150g离心5min，弃去上层清液；

③ 使用新鲜的培养基重悬细胞；

④ 吸管吸取适量细胞悬液，装入新的培养瓶，再加入适量的新鲜培养基，继续培养。