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隨著流式分析、細胞分選、單細胞組學(xué)、質(zhì)譜流式等研究技術(shù)的蓬勃發(fā)展，單細胞也在腫瘤免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等多個領(lǐng)域成為大眾的焦點，它能夠很好地反映細胞的特異性和異質(zhì)性。目前，組織（以腫瘤組織為例）制備成單細胞懸液的方法主要有機械解離法、酶解法和化學(xué)法（圖1）。

圖1 腫瘤組織制備成單細胞懸液的方法[1]

高質(zhì)量的初始樣本是實驗成功的關(guān)鍵。然而如何在此基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化粗懸液，獲得高質(zhì)量的單細胞懸液呢？基于三者的原理以及適用范圍等（表1），我們發(fā)現(xiàn)這些方法處理樣本時，沒有統(tǒng)一的標準。就機械法來說，每次實驗研磨的力道稍有不同，對細胞造成的損傷也不一樣，這樣就很難保證實驗的重復(fù)性。不僅如此，處理樣本的過程中，細胞可能會出現(xiàn)“死亡、碎片化、粘連"的情況，甚至某些組織如脾臟、心臟等還存在“紅細胞"這一干擾因素。

表1 組織制備單細胞懸液方法的區(qū)別

針對這些問題，我們“對癥下藥"，單細胞懸液質(zhì)量優(yōu)化的神兵利器主要有以下五種：

1、gentleMACS Dissociator：gentleMACS全自動組織溫和處理器可快速、溫和、安全、自動、便捷和標準化地將組織（如脾臟、肝臟、腫瘤、表皮等）處理成單細胞懸液，可謂是組織樣本處理的絕好幫手。其包含全自動組織解離器、zhuan利解離管和針對不同組織優(yōu)化的解離試劑盒，以及預(yù)設(shè)軟件程序在內(nèi)的整體方案，實現(xiàn)對不同組織樣本的優(yōu)化解離，確保細胞的活力、功能和表面表位的完好。能夠確保每一次解離都在優(yōu)化條件，同時解放雙手，結(jié)果也可以輕松重復(fù)。

2、預(yù)分離：粗懸液中的細胞團塊會導(dǎo)致細胞的不wan全標記或增加非特異性結(jié)合標記而分離得到許多非目的細胞。不僅如此，在一些后續(xù)的細胞培養(yǎng)過程中，細胞團塊也會影響細胞的最佳狀態(tài)，影響實驗結(jié)果。因此，我們可以在粗懸液制備后對其進行預(yù)分離，利用細胞濾器或篩網(wǎng)等，去除粗懸液中的細胞團塊。

3、死細胞去除：在二代測序，細胞分選等下游實驗中，死細胞將影響結(jié)果的準確性和有效性。死亡的細胞易裂解導(dǎo)致其中的RNA釋放出來，會導(dǎo)致檢測的背景噪聲，進而影響單細胞數(shù)據(jù)的質(zhì)量。此外，在細胞分選中，死細胞會影響捕獲細胞計數(shù)的準確性，不利于下游的細胞培養(yǎng)和功能驗證等實驗。需要注意的是，當細胞活率<30%時，不建議進行此項操作，去除死細胞后，細胞活率雖然達到90%以上，但大部分細胞都已經(jīng)死亡，細胞類型及分群會改變。

圖2 經(jīng)熱休克處理的外周血單核細胞（PBMC）死細胞去除前后細胞分群比較[2]

4、去除碎片：機械解離的研磨，酶解法的吹打，甚至是離心過程，都可能會產(chǎn)生細胞碎片。樣本制備過程中產(chǎn)生的細胞團、細胞碎片等會增加微流體芯片的堵塞風(fēng)險，也會增加流式等實驗中細胞的非特異性標記。我們可以通過嚴格控制上述操作的精度和力度來減少細胞碎片（難度較大），也可以使用細胞碎片去除試劑盒來優(yōu)化（方便快捷）。

圖3 成年大鼠心臟組織單細胞懸液去除碎片前后細胞群比較[2]

5、紅細胞裂解：諸如脾臟、心臟、肝臟等制備單細胞懸液都會涉及到紅細胞的裂解。紅細胞過多會導(dǎo)致有效細胞識別不準確、有效細胞-非細胞界限模糊、有核率低等問題。

圖4 成年大鼠心臟組織單細胞懸液（已去除碎片）進行紅細胞裂解前后比較[2]

相信有了這些法寶，小伙伴們一定能夠獲得高質(zhì)量單細胞懸液（表2），順利開展實驗啦!

表2 高質(zhì)量單細胞懸液質(zhì)控標準

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資料來源：

[1] Mitra A, Mishra L, Li S. Technologies for deriving primary tumor cells for use in personalized cancer therapy. Trends Biotechnol. 2013 Jun;31(6):347-54.

[2]美天旎