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使用SPEX組織研磨儀鑒定中藥材“銀柴胡”
閱讀：2761發(fā)布時(shí)間：2020-3-25
“銀柴胡”是中醫(yī)藥中清肺的常用中藥材。銀柴胡的功效是清虛熱、除疳熱，銀柴胡的作用是治陰虛發(fā)熱、骨蒸勞熱、小兒疳積發(fā)熱，銀柴胡用藥禁忌是外感風(fēng)寒及血虛。（具體用藥，請遵照醫(yī)生遺囑，使用專業(yè)醫(yī)師開具的藥方）
| 銀柴胡 《本草求原》：清肺、胃、脾、腎熱，兼能涼血。 《綱目拾遺》：謂熱在骨髓，非銀柴胡莫療，用以治虛勞肌熱骨蒸，勞瘧熱從髓出及小兒五疳贏熱，蓋退熱而不苦泄，理陰而不升騰，固虛熱之良藥。 |
銀柴胡作為在臨床及中成藥生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛的中藥材, 部分混偽品流入市場, 直接影響著相關(guān)中藥的質(zhì)量及臨床用藥安全。由于受鑒定人員經(jīng)驗(yàn)、種質(zhì)資源、藥材采收時(shí)期等因素影響, 利用傳統(tǒng)生藥鑒定的方法已經(jīng)難以滿足銀柴胡真?zhèn)舞b定的需求。
中文核心期刊《藥學(xué)學(xué)報(bào)》2019年05期中，一篇來自寧夏中藥材開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心李軍等人：“中藥材銀柴胡及其混偽品的DNA條形碼鑒定研究”的文中，選取4種候選條形碼序列ITS、psbA-trnH、rbcL 和matK, 以PCR擴(kuò)增和測序成功率、遺傳距離、變異率、Barcoding gap 及進(jìn)化樹等為指標(biāo), 分析其對銀柴胡及其混偽品的鑒別情況。
文中使用篩選合適的DNA條形碼序列,以建立基于DNA條形碼技術(shù)的銀柴胡及其混偽品鑒定方法。該研究團(tuán)隊(duì)共收集了60份銀柴胡及其混偽品，進(jìn)行DNA提取：取經(jīng)鑒定的銀柴胡及其混偽品基原植物樣品30 mg, 干燥藥材去除表皮取中間部分50 mg,加入GP1 緩沖液和鋼珠2 枚, 經(jīng)高通量組織研磨機(jī)（美國SPEX公司 Geno 2010）研磨4 或6 min 后, 采用DNA 提取試劑盒提取總DNA,詳細(xì)操作參照試劑盒說明書。
SPEX 高通量組織研磨儀，可一批次處理6塊深孔板，共576個(gè)樣品，可進(jìn)行干磨、濕磨、低溫研磨，可快速粉碎樣品，并保障樣品完整性，對研磨中藥材非常有效，是中藥材研究的利器。
而后對4種DNA條形碼序列ITS、psb A-trn H、rbc L和mat K進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序,計(jì)算各序列PCR擴(kuò)增和測序成功率;利用MEGA7.0分析序列特征、計(jì)算遺傳距離,并構(gòu)建Neighbour-joining (NJ)系統(tǒng)進(jìn)化樹;利用種間種內(nèi)變異分析做Barcoding gap圖;運(yùn)用BLAST方法計(jì)算各序列鑒定成功率,通過以上指標(biāo)綜合評價(jià)不同序列的鑒別能力。
結(jié)果顯示, ITS序列的PCR擴(kuò)增及測序成功率zui高,為95.2%, matK低,為75%; 4種序列的長度范圍為211～797 bp, ITS的GC含量在各序列中zui高,為54.35%; matK和ITS的鑒定成功率較高,分別為92%和90%; Barcoding gap圖顯示ITS有明顯的間隔區(qū), rbc L、mat K和psb A-trn H序列間隔區(qū)不明顯或種間種內(nèi)變異有部分重疊; NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示, ITS可將銀柴胡聚為一支,同屬混偽品二柱繁縷與銀柴胡明顯分為不同支, rbc L和mat K不能把混偽品二柱繁縷分開。因此, ITS序列可作為銀柴胡及其混偽品鑒定的優(yōu)選條形碼序列,為銀柴胡的真?zhèn)舞b定提供科學(xué)依據(jù)。
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