FS1224-Rhod-2, AM, 鈣離子熒光探針

FS1224-Rhod-2, AM, 鈣離子熒光探針

產(chǎn)品簡介

Rhod-2 是一種高親和力的可見光激發(fā)波長 Ca2+熒光探針。類似于 Fluo-3 或 Fluo-4，其激發(fā)和發(fā)射光譜不會隨著 Ca2+濃度變化發(fā)生明顯的遷移，熒光信號一旦與 Ca2+結(jié)合后明顯增強。不同于 Fluo-3 或 Fluo-4，Rhod-2的波長更長（Ex/Em=549/578 nm），這一特性使其更適合具高水平自熒光信號細(xì)胞或組織的 Ca2+水平檢測，還可用來檢測由光感受器和籠鎖Ca2+螯合劑光激活導(dǎo)致的Ca2+釋放。Rhod-2, AM 是Rhod-2 的一種乙酰甲酯衍生物，具有細(xì)胞膜滲透性，只需簡單培養(yǎng)，即可輕易進入細(xì)胞。一旦進入細(xì)胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的 Rhod-2，從而滯留在胞內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)生理功能。

本品以凍干粉的形式提供，使用時只需經(jīng)無水 DMSO 充分溶解，配置成 2~5mM 的儲存液，并依據(jù)具體實驗和相關(guān)文獻(xiàn)資料調(diào)整到需要的工作濃度即可。Indo-1, AM是Indo-1的一種乙酰甲酯衍生物，具有細(xì)胞膜滲透性，只需簡單培養(yǎng)，即可輕易進入細(xì)胞。一旦進入細(xì)胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Indo-1，從而滯留在胞內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)生理功能。

基本特性

CAS ：129787-64-0

化學(xué)名：9-[4-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-3-[2-[2-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-

oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]phenyl]-3,6-bis(dimethylamino)-xanthylium, monobromide

同義名：Rhod-2, Acetoxymethyl Ester

分子式：C52H59BrN4O19

分子量：1123.94

外觀：紅色固體

最大激發(fā)/發(fā)射波長：549/578 nm

Kd（Ca2+結(jié)合）：570nM

溶解性：溶于 DMSO（2~5mM）

儲存條件：-20℃避光干燥保存，1年有效。

使用方法（僅供參考）

一、試劑準(zhǔn)備

1）配制 Pluronic F-127 母液：稱取 100mg Pluronic F-127 粉末（貨號：Cat No. FS0432）中加入 500μl DMSO，配制成 20%(w/v) DMSO 母液。溶解過程需要在 40-50℃加熱 20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2）HHBS Buffer (1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3)（貨號：Cat No. FSH043） 或者其他生理緩沖液

二、操作步驟

1）用無水 DMSO 溶解 Rhod-2, AM 配制成 2-5mM 的儲存液，或?qū)⒁雅浜玫?nbsp;Rhod-2, AM 儲存液取出于室溫回溫。（如：若配制成 4mM 的母液，需向 50µg Rhod-2, AM 中加入 11.1µl 無水 DMSO（貨號：Cat No. FS0306）。準(zhǔn)備 Rhod-2, AM 工作液之前，有時需要往 Rhod-2, AM 儲存液中加入適量的 20% Pluronic F-127 溶液，以增強 AM探針的水溶性。

【注①】：Rhod-2, AM 染色工作液制備前，添加等體積 20% Pluronic F-127 溶液到 Rhod-2, AM+DMSO儲存液，從而使 Pluronic F-127 的最終工作濃度約為 0.02%。

【注②】：Pluronic F-127 可以防止 AM 探針在溶液中聚合并促使探針更好進入細(xì)胞。但 Pluronic F-127

可降低 AM 探針的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時加入，不建議加入儲存液長期保存。

2）用 HHBS 或其他生理緩沖液將 Rhod-2, AM+DMSO 儲存液稀釋到 1-10µM 的工作液。

【注①】：Rhod-2,AM 應(yīng)用在大部分細(xì)胞的推薦加載濃度為 4-5µM，具體的使用濃度需根據(jù)實驗要求

進行優(yōu)化。為了避免過度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用zui低探針濃度。

【注②】：Rhod-2, AM 工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍存。

3）【可選】如果細(xì)胞內(nèi)含有機陰離子轉(zhuǎn)運體，丙黃舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，

0.1-0.25mM）可能需要加入細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，以降低去酯化探針的泄露水平。

【注①】：丙黃舒或磺吡酮儲存液相當(dāng)偏堿，因此加入培養(yǎng)基后需要重新調(diào)整 pH。

4）將準(zhǔn)備好的 Rhod-2, AM 工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。37℃孵育 20min-2h。

【注①】：若使用含血清的培養(yǎng)基，血清內(nèi)酯酶會降解 AM，從而降低 Rhod-2, AM 加載效果。而含酚

紅培養(yǎng)基會使本底值略偏高，建議加入染色工作液前，對細(xì)胞清洗 2~3 次。

【注②】：關(guān)于孵育的時間，如果初次做實驗不能確定，建議先孵育 30min，看熒光效果；如果細(xì)胞死

亡較多，適當(dāng)縮短時間；如果熒光強度太弱，適當(dāng)延長時間。

【注③】：降低探針加載溫度可能會降低探針的區(qū)室化現(xiàn)象。

5）吸掉染色工作液，并用 HHBS 或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉(zhuǎn)運體抑制劑如 2.5mM 丙黃舒的緩沖液）清洗細(xì)胞 1~2 次，以去除殘留探針。

6）室溫再孵育 30min 以保證細(xì)胞內(nèi) AM 的wan全去酯化。

7）用適當(dāng)?shù)膬x器如激光共聚焦、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀，以及波長 Ex/Em=549/578 nm 來進行檢測。注意事項

1）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2）熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

3）Rhod-2從低濃度Ca2+到高濃度Ca2+的熒光增強程度低于Fluo-3，Rhod-2的熒光信號弱于Fluo-3。

4）乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環(huán)境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

5）Rhod-2, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

6）Rhod-2, AM第一次使用，建議儲存液現(xiàn)配現(xiàn)用，分裝成單次用量，嚴(yán)格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實驗效果，盡量在短時間內(nèi)使用。

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