FSQ-201東洋紡TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒

zui適用于Realtime PCR用cDNA合成的預(yù)混型逆轉(zhuǎn)錄試劑。 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(Code No. FSQ-201)是利用本公司高性能逆轉(zhuǎn)錄酶『ReverTra Ace』開(kāi)發(fā)的Realtime PCR用的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，是包含逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用的所有組分的5×濃度的*預(yù)混型試劑，只需添加模板RNA和水即可迅速地開(kāi)始反應(yīng)。另外，由于采用了zui適用于Realtime PCR用短鏈目的片段cDNA合成的反應(yīng)組成，可在短時(shí)間內(nèi)高效率地制備適用于Realtime PCR的cDNA模板。   ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code No. FSQ-301)中添附了具有強(qiáng)力DNA分解活性的gDNA Remover，通過(guò)在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前處理模板RNA，可簡(jiǎn)便地制備不含基因組DNA的cDNA。zui適用于檢測(cè)目的基因中存在假基因，或無(wú)法在橫跨內(nèi)含子的位置上設(shè)計(jì)引物，模板RNA中有基因組DNA殘留問(wèn)題等Realtime PCR實(shí)驗(yàn)。 【相關(guān)產(chǎn)品】Realtime PCR試劑的詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)點(diǎn)擊這里。 FSQ-201東洋紡TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix

特征1. *預(yù)混型試劑
本試劑是在−20℃條件下也不會(huì)凍結(jié)的*預(yù)混型試劑。只需添加模板RNA和水，即可簡(jiǎn)便地合成重復(fù)性良好的cDNA。

特征2. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(−)對(duì)照溶液容易配制
由于添附有同樣預(yù)混型的no-RT Control，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（−）對(duì)照溶液也很容易配制。

特征3. 實(shí)現(xiàn)了更廣的可定量擴(kuò)增區(qū)域（dynamic rang）
由于采用了Oligo dT和Random Primer按*比例混合的primer mix，RNA的整個(gè)區(qū)域可進(jìn)行均一、高效率的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。因此，可對(duì)更廣的可定量擴(kuò)增區(qū)域進(jìn)行分析。

特征4. 與Realtime PCR試劑的高適應(yīng)性
采用了對(duì)Realtime PCR的反應(yīng)體系影響zui小的組分，即便向PCR反應(yīng)液中帶入zui多20%液量的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，也能顯示出很好的線性。zui適用于低表達(dá)量mRNA的高靈敏度檢測(cè)。

特征5. 可簡(jiǎn)便、迅速地去除基因組DNA<ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover>
按順序添加去除基因組DNA的試劑和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑，只需20分鐘即可配制不含基因組DNA的cDNA。
 

以HeLa total RNA100ng為模板，按各公司試劑盒的推薦條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再用Realtime PCR對(duì)5種目的基因進(jìn)行定量。
結(jié)果可見(jiàn)，用本試劑盒可得到zui高合成量。

●cDNA合成 試劑：ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（Code No.FSQ-201）及其他公司同類型（預(yù)混型）產(chǎn)品 模板：HeLa total RNA 100ng /10μl反應(yīng)體系 反應(yīng)條件：各公司試劑盒推薦的條件

●Realtime PCR
試劑：THUNDERBIRD SYBR^® qPCR Mix（Code No.QPS-201）
模板：上述cDNA 2μl/20μl反應(yīng)體系(帶入量10%)
目的片段：代表性基因5種
測(cè)定用儀器：Applied Biosystems 7900HT

為評(píng)價(jià)模板RNA量對(duì)逆轉(zhuǎn)錄合成效率的影響，以HeLa total RNA 2pg?2μg（8個(gè)梯度）為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再用Realtime PCR對(duì)5種目的基因進(jìn)行定量。結(jié)果可見(jiàn)，5種目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線沒(méi)有交叉，顯示了很好的直線性。由此可見(jiàn)，用本試劑盒可對(duì)各種濃度范圍的RNA進(jìn)行同等效率的逆轉(zhuǎn)錄。

●cDNA合成 試劑：ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（Code No.FSQ-201） 模板：HeLa total RNA 2pg-2μg /20μl反應(yīng)體系 ●Realtime PCR 試劑：THUNDERBIRD SYBR® qPCR Mix（Code No.QPS-201） 模板：上述cDNA2μl/20μl反應(yīng)體系（帶入量10%） 目的片段：代表性House Keeping Gene 5種 測(cè)定用儀器：Applied Biosystems 7900HT

為了確認(rèn)gDNA Remover去除基因組DNA的效果，按以下條件進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再以β-Actin為目的片段進(jìn)行Realtime PCR。
結(jié)果可見(jiàn)，gDNA Remover處理（＋）、逆轉(zhuǎn)錄（−）<下面③>的條件下無(wú)法確認(rèn)到擴(kuò)增，說(shuō)明基因組DNA已被去除。

●cDNA合成 試劑：ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（Code No.FSQ-301） 模板：自制的HeLa total RNA 0.5μg /10μl反應(yīng)體系 條件：用gDNA Remover添加（＋）、或不添加（−）的4×DN Master Mix去除gDNA后，再分別用5×RT Master MixⅡ或5×RT Master Mix Ⅱ no-RT Control進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

●Realtime PCR
試劑：THUNDERBIRD SYBR^® qPCR Mix（Code No.QPS-201）
模板：上述cDNA 2μl/20μl反應(yīng)體系（帶入量10%）
目的片段：ACTB（188bp）
測(cè)定用儀器：Applied Biosystems 7900HT
 

向HeLa total RNA中添加過(guò)量的人基因組DNA，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)，與其他公司同類型產(chǎn)品比較去除基因組DNA的效果。
結(jié)果可見(jiàn)，ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover去除基因組DNA的效果。

●cDNA合成 試劑：ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（Code No.FSQ-301）及其他公司同類型試劑盒2種 模板：HeLa total RNA（0, 1pg, 10pg, 100pg, 1ng, 10ng,100ng, 1μg）＋人gDNA 100ng/20μl反應(yīng)體系 條件：各公司試劑盒的推薦條件 ●Realtime PCR 試劑：THUNDERBIRD SYBR® qPCR Mix（Code No.QPS-201） 模板：上述cDNA 2μl/20μl反應(yīng)體系（帶入量10%） 目的片段：ACTB（188bp） 測(cè)定用儀器：Applied Biosystems 7900HT

Q1. 推薦反應(yīng)時(shí)間為15分鐘，如果延長(zhǎng)時(shí)間能否提高cDNA的合成量？
A1. tRNA等量很多的RNA全部進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可提高收量，但一般情況下推薦37℃15分鐘可得到足夠的cDNA。

Q2. 哪些RNA可作為模板RNA使用？  
 A2. Total RNA、mRNA、tRNA、rRNA等各種RNA都可以使用。

Q.3 是否需要RNase H處理？  
 A3. 由于模板RNA的殘留會(huì)對(duì)PCR產(chǎn)生抑制作用，一般情況下，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后需通過(guò)RNase H對(duì)模板RNA進(jìn)行分解。但本試劑盒采用了本公司新開(kāi)發(fā)的系統(tǒng)，模板RNA在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后會(huì)被非酶性去除，因此逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后無(wú)需進(jìn)行RNase H處理。
 

1）K.Miyazaki et al.,J.Bacteriology.,185:2219−2226（2003）
2）A.Nezu et al.,Biochem.J.,263:59−66（2002）
3）S.Nakashima et al.,J.Biochem.(Tokyo),131:241−246（2002）
4）S.Atsumi et al.,EMBO J.,20:5453−5460（2001）
5）Y.Yabuta et al.,Plant Cell Physiol.,41:666−675（2000）
6）S.Lee et al.,Gene,245:253−266（2000）